| 查看: 1745 | 回复: 3 | ||
Anthony07新虫 (初入文坛)
|
[求助]
【求助/交流】假单胞菌RED重组系统最后检验PCR没有条带
|
 本人用RED重组系统敲除来敲除假单胞菌的某一基因，之前一直都能P出置换过的抗性条带，自从疫情后，再次验证完全P不出条带了。我重新开始制备，我的具体步骤是用pcm130扩增出的抗四环素基因（上下游添加20bp的同源臂，之前是35bp，但是Tm值太大，缩减成20bp，之前也成功扩出来了。），然后电转化到带有Pkd46的假单胞菌感受态（制备感受态前大摇用了L-阿拉伯糖诱导过，制备感受态用的是10%的甘油多次离心，全程4度制备），10ul的目的片段+100ul的感受态混匀冰浴30min后电转，然后在加有氨苄和四环素的抗性LB平板上涂布（也加了L-阿拉伯糖）然后 隔夜培养也长出了密密麻麻的单菌落，然后扩大培养也能摇起来，然后做菌液PCR扩增四环素抗性条带（也提过基因组DNA去P，cDNA也试过），试过多次，只有引物二聚体，很懵逼，不知道哪里出错了。有木有大神给点建议，该如何整。都能在双抗性的平板上长出单菌落，却没办法P出条带，然后拿这个菌也扩增不出16s，有考虑过是不是真菌污染，扩增过18s，没条带，确认没有污染。请求大神帮忙，感激不尽！ |
回复此楼» 猜你喜欢
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
-
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有167人回复
-
RMC-6291怎么用？RAS(ON) 三重复合物工具化合物的实验室实操要点
已经有0人回复
-
苯并呋咱全解析：NBD 荧光衍生化试剂母核的化学特性与实验室应用
已经有0人回复
-
生物质炭与活化剂氢氧化钾混合注意事项
已经有0人回复
-
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
slcat
新虫 (著名写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 26305.2
- 散金: 500
- 红花: 1
- 帖子: 2659
- 在线: 12.5小时
- 虫号: 1741741
- 注册: 2012-04-07
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2020-06-08 22:31:34
Anthony07
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 130.6
- 帖子: 44
- 在线: 6.6小时
- 虫号: 8048805
- 注册: 2018-02-19
- 性别: GG
- 专业: 微生物生态学
3楼2020-06-08 22:35:08
4楼2020-06-08 23:50:40