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Anthony07新虫 (初入文坛)
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[求助]
【求助/交流】假单胞菌RED重组系统最后检验PCR没有条带
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 本人用RED重组系统敲除来敲除假单胞菌的某一基因，之前一直都能P出置换过的抗性条带，自从疫情后，再次验证完全P不出条带了。我重新开始制备，我的具体步骤是用pcm130扩增出的抗四环素基因（上下游添加20bp的同源臂，之前是35bp，但是Tm值太大，缩减成20bp，之前也成功扩出来了。），然后电转化到带有Pkd46的假单胞菌感受态（制备感受态前大摇用了L-阿拉伯糖诱导过，制备感受态用的是10%的甘油多次离心，全程4度制备），10ul的目的片段+100ul的感受态混匀冰浴30min后电转，然后在加有氨苄和四环素的抗性LB平板上涂布（也加了L-阿拉伯糖）然后 隔夜培养也长出了密密麻麻的单菌落，然后扩大培养也能摇起来，然后做菌液PCR扩增四环素抗性条带（也提过基因组DNA去P，cDNA也试过），试过多次，只有引物二聚体，很懵逼，不知道哪里出错了。有木有大神给点建议，该如何整。都能在双抗性的平板上长出单菌落，却没办法P出条带，然后拿这个菌也扩增不出16s，有考虑过是不是真菌污染，扩增过18s，没条带，确认没有污染。请求大神帮忙，感激不尽！ |
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