应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测序引物Tm的问题
161/2返回列表12下一页
查看: 1834  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

gastrodia

金虫 (正式写手)

[交流] 测序引物Tm的问题

小弟有一个测续引物Tm值的问题，通常克隆后会进行菌落PCR验证，所用引物大多是一些质粒的通用引物如M13（+、-）SP6 T7之流，大多数人所使用的退火温度多为55摄氏度。
我也是使用55度作为退火温度，也做了很多克隆的验证，今天偶然研究了一下这些通用引物的Tm值，有些疑问特地与各位大虾商讨。
M13/pUC Sequencing Primer (-20)                GTAAAACGACGGCCAGT        52
M13/pUC Sequencing Primer (-40)                GTTTTCCCAGTCACGAC        49
M13／pUC Sequencing Primer（-47）        CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 72.06
M13／pUC Reverse Sequencing Primer        AACAGCTATGACCATG        41.95
M13／pUC reverse Sequencing Primer        CAGGAAACAGCTATGAC        44.37
M13／pUC Reverse Sequencing Primer        AGCGGATAACAATTTCACACA        56.68
Sp6                                                                CATACGATTTAGGTGACACTATAG 51.46
T7                                                                TAATACGACTCACTATAGGGCGA 56.66
以上海生工的通用引物为例，从左到右分别为引物名称，序列，Tm值，Tm计算工具的网址：http://www.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/，参数：Salt Concentration (50mM) ，Primer Concentration (0.2μM)，从上述数据看出有几个引物的Tm明显低于55度，我们实验室做菌落PCR时使用的引物为M13／pUC Sequencing Primer（-47）和M13／pUC Reverse Sequencing Primer，这两个的Tm一个为72.06，一个是41.95，我退火温度为55的PCR居然一次又一次的扩出条带，我不知该做和解释，我们实验室使用SP6T7时退火温度也通常设为55度，请问各位大侠是否探讨过？如能释我疑问，我将不胜感激。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-07-11 18:06:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):鼓励一下！ 7-11 18:58
Tm是半数解链温度
而所谓的结合解离都是一个分子热运动的过程，并非静态的，总会碰撞的，只是几率的大小而已
能扩出来并不奇怪
用质粒扩则更好扩
赞一下(7人) 回复此楼
2楼2009-07-11 18:56:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

honghui9251

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):支持一个！ 7-12 10:37
正反引物tm相差最好小于5
赞一下(11人) 回复此楼
3楼2009-07-12 09:58:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
顶一下
这个还没有研究过
关注中……
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2009-07-12 11:29:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by honghui9251 at 2009-7-12 09:58:
正反引物tm相差最好小于5

我觉得你要么没看我的话题，要么就是草草看了一下，我问的是通用引物的Tm值差异问题，差异很大时仍然能PCR出片段，至于你说的正反引物tm相差最好小于5 ，我想一般做分子的人大多都会晓得。你要是能解释，就发表一下高见，你来这一句话对问题的解决根本没有帮助
赞一下 回复此楼
5楼2009-07-12 14:46:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangtengxu

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
Tm不是绝对的，只是一个参考值，能扩出来说明，退火温度下能结合，而结合因素是多方面的。
赞一下(1人) 回复此楼
想和有趣的人一起做有趣的事。
6楼2009-07-12 15:25:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

magiccat

木虫 (正式写手)
我们做的一般都取上游引物和下游引物TM值得中间值
赞一下 回复此楼
7楼2009-08-07 18:45:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

695

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by wangtengxu at 2009-7-12 15:25:
Tm不是绝对的，只是一个参考值，能扩出来说明，退火温度下能结合，而结合因素是多方面的。

说的太好哦了
回复此楼
8楼2009-08-07 19:40:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

spiderboy

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
6楼说得对。。55摄氏度只是我们设定的最初参照值。。实验中往往出现和我们常规认识不相符的情况。这就说明了影响退火温度的因素是很多的，不仅仅是碱基的组成，还有引物的长度，引物的结构，模板的结构和状态。。。而最后一个因素往往很重要。。比如用复杂的多倍体基因组来做模板，而且所要扩增的序列又是在保守区域，那常规的引物设计原则可能不太适用了。。因为这个时候是模板的状态起到主要的影响作用。。对于质粒这种小分子量且结构简单的模板来说，在很大的波动范围内都是很好扩的。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2009-08-08 14:22:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liugang66

铁杆木虫 (职业作家)

小鸟伯德
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by spiderboy at 2009-8-8 14:22:
6楼说得对。。55摄氏度只是我们设定的最初参照值。。实验中往往出现和我们常规认识不相符的情况。这就说明了影响退火温度的因素是很多的，不仅仅是碱基的组成，还有引物的长度，引物的结构，模板的结构和状态。。 ...

学习了
回复此楼
有梦就有力量，有心就会成功！
10楼2009-08-08 15:14:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 gastrodia 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +6 wangze12014 2026-08-14 7/350 2026-08-15 20:12 by gltch
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +8 majunge000 2026-08-11 10/500 2026-08-15 18:55 by Equinoxhua
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +7 Ldrop2023 2026-08-13 7/350 2026-08-15 15:57 by mzhh2000
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭