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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 测序引物Tm的问题
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gastrodia

金虫 (正式写手)

[交流] 测序引物Tm的问题

小弟有一个测续引物Tm值的问题，通常克隆后会进行菌落PCR验证，所用引物大多是一些质粒的通用引物如M13（+、-）SP6 T7之流，大多数人所使用的退火温度多为55摄氏度。
我也是使用55度作为退火温度，也做了很多克隆的验证，今天偶然研究了一下这些通用引物的Tm值，有些疑问特地与各位大虾商讨。
M13/pUC Sequencing Primer (-20)                GTAAAACGACGGCCAGT        52
M13/pUC Sequencing Primer (-40)                GTTTTCCCAGTCACGAC        49
M13／pUC Sequencing Primer（-47）        CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 72.06
M13／pUC Reverse Sequencing Primer        AACAGCTATGACCATG        41.95
M13／pUC reverse Sequencing Primer        CAGGAAACAGCTATGAC        44.37
M13／pUC Reverse Sequencing Primer        AGCGGATAACAATTTCACACA        56.68
Sp6                                                                CATACGATTTAGGTGACACTATAG 51.46
T7                                                                TAATACGACTCACTATAGGGCGA 56.66
以上海生工的通用引物为例，从左到右分别为引物名称，序列，Tm值，Tm计算工具的网址：http://www.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/，参数：Salt Concentration (50mM) ，Primer Concentration (0.2μM)，从上述数据看出有几个引物的Tm明显低于55度，我们实验室做菌落PCR时使用的引物为M13／pUC Sequencing Primer（-47）和M13／pUC Reverse Sequencing Primer，这两个的Tm一个为72.06，一个是41.95，我退火温度为55的PCR居然一次又一次的扩出条带，我不知该做和解释，我们实验室使用SP6T7时退火温度也通常设为55度，请问各位大侠是否探讨过？如能释我疑问，我将不胜感激。
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1楼 2009-07-11 18:06:42
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
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6楼说得对。。55摄氏度只是我们设定的最初参照值。。实验中往往出现和我们常规认识不相符的情况。这就说明了影响退火温度的因素是很多的，不仅仅是碱基的组成，还有引物的长度，引物的结构，模板的结构和状态。。。而最后一个因素往往很重要。。比如用复杂的多倍体基因组来做模板，而且所要扩增的序列又是在保守区域，那常规的引物设计原则可能不太适用了。。因为这个时候是模板的状态起到主要的影响作用。。对于质粒这种小分子量且结构简单的模板来说，在很大的波动范围内都是很好扩的。
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9楼2009-08-08 14:22:02
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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amisking(金币+2,VIP+0):鼓励一下！ 7-11 18:58
Tm是半数解链温度
而所谓的结合解离都是一个分子热运动的过程，并非静态的，总会碰撞的，只是几率的大小而已
能扩出来并不奇怪
用质粒扩则更好扩
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2楼2009-07-11 18:56:30
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honghui9251

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):支持一个！ 7-12 10:37
正反引物tm相差最好小于5
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3楼2009-07-12 09:58:56
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
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顶一下
这个还没有研究过
关注中……
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4楼2009-07-12 11:29:22
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