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测序引物Tm的问题
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小弟有一个测续引物Tm值的问题，通常克隆后会进行菌落PCR验证，所用引物大多是一些质粒的通用引物如M13（+、-）SP6 T7之流，大多数人所使用的退火温度多为55摄氏度。 我也是使用55度作为退火温度，也做了很多克隆的验证，今天偶然研究了一下这些通用引物的Tm值，有些疑问特地与各位大虾商讨。 M13/pUC Sequencing Primer (-20) GTAAAACGACGGCCAGT 52 M13/pUC Sequencing Primer (-40) GTTTTCCCAGTCACGAC 49 M13／pUC Sequencing Primer（-47） CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 72.06 M13／pUC Reverse Sequencing Primer AACAGCTATGACCATG 41.95 M13／pUC reverse Sequencing Primer CAGGAAACAGCTATGAC 44.37 M13／pUC Reverse Sequencing Primer AGCGGATAACAATTTCACACA 56.68 Sp6 CATACGATTTAGGTGACACTATAG 51.46 T7 TAATACGACTCACTATAGGGCGA 56.66 以上海生工的通用引物为例，从左到右分别为引物名称，序列，Tm值，Tm计算工具的网址：http://www.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/，参数：Salt Concentration (50mM) ，Primer Concentration (0.2μM)，从上述数据看出有几个引物的Tm明显低于55度，我们实验室做菌落PCR时使用的引物为M13／pUC Sequencing Primer（-47）和M13／pUC Reverse Sequencing Primer，这两个的Tm一个为72.06，一个是41.95，我退火温度为55的PCR居然一次又一次的扩出条带，我不知该做和解释，我们实验室使用SP6T7时退火温度也通常设为55度，请问各位大侠是否探讨过？如能释我疑问，我将不胜感激。 |
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