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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 点突变求助，求问关于大肠杆菌对线性质粒的修复过程
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al597032982

铁虫 (初入文坛)

[求助] 点突变求助，求问关于大肠杆菌对线性质粒的修复过程 已有1人参与

各位大佬请问一下我把环P后的突变质粒用DpnI消化后胶回收纯化，然后直接转化到大肠杆菌中，但是测序的时候发现在P出的两个末端之间插入了整数个引物的序列，一般在十个左右，按理说应该已经除掉引物和模板碎片了，不知道为什么还会有这种情况。
PCR的引物一开始用的是反向互补的，插入现象很严重，几乎所有阳性克隆都有插入片段；后来改用不完全互补的引物之后，稍微好了点但是也有个别的出现了插入，这样看应该也不是PCR引入的啊。
另外想请问一下大肠杆菌的连接酶的工作原理，是连接任意平末端么。
谢谢大佬们。
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1楼 2020-06-03 17:00:54
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)
能说一下你做这个实验的目的是什么吗？是要在质粒上基因中引入点突变？
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2楼2020-06-03 18:57:07
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小汰宝

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是引物出现了我P我自己现象...（没有理论依据，我瞎猜的）

我也遇到过这个情况，当时选择无视..反正最后只要找到一个正确克隆的点就可以了。你是做定点突变是么？

长出点了以后批量菌落pcr,把大小正确的送测，选中正确克隆的几率会高些
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3楼2020-06-06 09:51:39
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