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susizheng木虫 (著名写手)
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关于载体自连的问题已有1人参与
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在此和各位虫虫探讨一个问题。 相信各位虫虫也可能遇到过。 就是在构建测序载体或表达载体的时候总是遇到载体自连的问题，即筛选时出现很多假阳性。 当然一般的表达载体自连是因为载体双酶切回收的时候单个位点酶切的载体一并回收了，导致后期连接的时候自连。那么T载呢？没有相同的粘性末端却也出现了自连的情况。同学说T4 Ligase 具有聚合酶活性，是这样的吗？ 各位虫虫有何高见？ 另外有什么方法能够减少引物自连的问题呢？ 我一般连T，阳性克隆为80%左右，连pET28时有20%就很不错了，大多是自连。 [ Last edited by susizheng on 2009-7-10 at 17:24 ] |
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