应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于载体自连的问题
141/2返回列表12下一页
查看: 2224  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

[交流] 关于载体自连的问题 已有1人参与

在此和各位虫虫探讨一个问题。
相信各位虫虫也可能遇到过。
就是在构建测序载体或表达载体的时候总是遇到载体自连的问题，即筛选时出现很多假阳性。
当然一般的表达载体自连是因为载体双酶切回收的时候单个位点酶切的载体一并回收了，导致后期连接的时候自连。那么T载呢？没有相同的粘性末端却也出现了自连的情况。同学说T4 Ligase 具有聚合酶活性，是这样的吗？
各位虫虫有何高见？
另外有什么方法能够减少引物自连的问题呢？
我一般连T，阳性克隆为80%左右，连pET28时有20%就很不错了，大多是自连。

[ Last edited by susizheng on 2009-7-10 at 17:24 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
Thank-you，so-blue.
1楼 2009-07-10 17:22:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
t载体主要有切平端后加t的和引入酶切点后切出t末端的。加t的载体，很多就根本没加上，平端当然自连。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2009-07-10 18:37:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

weilin2378

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
适当减少载体的用量或增加模板量可以减少自连
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2009-07-10 20:34:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

11014612

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果太严重可以用碱性磷酸酶处理下吧
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2009-07-10 20:48:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zplipeng

金虫 (著名写手)
都是高手，学习了。。。
回复此楼
加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
5楼2009-07-10 21:36:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w.king124

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我用的是Taraka的pmd18T载体，很少有自连的情况
如果是做单酶切的话肯定得做去磷酸化，双酶切基本不用吧
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2009-07-10 21:41:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):鼓励一下！ 7-11 18:39
连T载体一般不会出现自连的情况,可用蓝白斑筛选
连表达载体的时候有时会出现自连,我也经常遇到过,多切多连总会遇到成功的
去磷酸化,有时也会自连的,我曾做过去磷酸化,基本没什么效果,可能是技术问题吧,后来还是按常规方法做
赞一下(7人) 回复此楼
7楼2009-07-11 16:17:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
平端是自连的概率大
黏端可能是根本没切开
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2009-07-11 16:43:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):鼓励一下！ 7-11 18:39
市面所受T-vector多数都是在lac_Z处使用平端酶处理，然后加T，这种做法并不能保证所有的线性分子都加上这个T，而且多次冻融同样可以失T，因此自联多有发生，现在在大肠杆菌中已有一种致死基因的筛选系统，国内的代用品不知道是否已开发出来，如果有将是做常规克隆的一大幸事，表达载体自联，关键是看你用的是什么酶，它的切点如何，切割是否完全，
赞一下(7人) 回复此楼
9楼2009-07-11 18:12:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
学习了。谢谢楼上各位。
赞一下 回复此楼
Thank-you，so-blue.
10楼2009-07-12 17:35:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 susizheng 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿北京化工大学070300 学硕336求调剂 +5 vv迷 2026-03-21 8/400 2026-03-22 14:20 by ColorlessPI
[考研] 求调剂一志愿海大，0703化学学硕304分，有大创项目，四级已过 +3 幸运哩哩 2026-03-22 6/300 2026-03-22 14:12 by 30660438
[考博] 招收博士1-2人 +3 QGZDSYS 2026-03-18 4/200 2026-03-22 10:25 by QGZDSYS
[考研] 生物学一志愿985，分数349求调剂 +4 zxts12 2026-03-21 7/350 2026-03-22 09:57 by zxts12
[考研] 286分人工智能专业请求调剂愿意跨考！ +4 lemonzzn 2026-03-17 8/400 2026-03-21 22:49 by lemonzzn
[考研] 资源与环境 调剂申请(333分) +5 holy J 2026-03-21 5/250 2026-03-21 22:42 by Catalysis25
[考研] 085601调剂 358分 +3 zzzzggh 2026-03-20 4/200 2026-03-21 10:21 by luoyongfeng
[考研] 316求调剂 +6 梁茜雯 2026-03-19 6/300 2026-03-21 06:32 by Ecowxq666！
[考研] 085700资源与环境308求调剂 +12 墨墨漠 2026-03-18 13/650 2026-03-21 01:42 by JourneyLucky
[考研] 华东师范大学-071000生物学-293分-求调剂 +3 研究生何瑶明 2026-03-18 3/150 2026-03-21 01:30 by JourneyLucky
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +5 守候夕阳CF 2026-03-18 5/250 2026-03-21 01:06 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:46 by JourneyLucky
[考研] 一志愿武汉理工材料工程专硕调剂 +9 Doleres 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:36 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 @taotao 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:35 by JourneyLucky
[考研] 261求B区调剂，科研经历丰富 +3 牛奶很忙 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:34 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 eation27 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:32 by JourneyLucky
[考研] 环境工程调剂 +9 大可digkids 2026-03-16 9/450 2026-03-20 17:38 by 醉在风里
[考研] 材料与化工求调剂 +7 为学666 2026-03-16 7/350 2026-03-19 14:48 by 尽舜尧1
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭