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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于载体自连的问题
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

[交流] 关于载体自连的问题 已有1人参与

在此和各位虫虫探讨一个问题。
相信各位虫虫也可能遇到过。
就是在构建测序载体或表达载体的时候总是遇到载体自连的问题，即筛选时出现很多假阳性。
当然一般的表达载体自连是因为载体双酶切回收的时候单个位点酶切的载体一并回收了，导致后期连接的时候自连。那么T载呢？没有相同的粘性末端却也出现了自连的情况。同学说T4 Ligase 具有聚合酶活性，是这样的吗？
各位虫虫有何高见？
另外有什么方法能够减少引物自连的问题呢？
我一般连T，阳性克隆为80%左右，连pET28时有20%就很不错了，大多是自连。

[ Last edited by susizheng on 2009-7-10 at 17:24 ]
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Thank-you，so-blue.
1楼 2009-07-10 17:22:47
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
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t载体主要有切平端后加t的和引入酶切点后切出t末端的。加t的载体，很多就根本没加上，平端当然自连。
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2楼2009-07-10 18:37:19
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weilin2378

木虫 (小有名气)
★
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适当减少载体的用量或增加模板量可以减少自连
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3楼2009-07-10 20:34:50
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11014612

银虫 (初入文坛)
★
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如果太严重可以用碱性磷酸酶处理下吧
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4楼2009-07-10 20:48:33
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zplipeng

金虫 (著名写手)
都是高手，学习了。。。
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加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~
5楼2009-07-10 21:36:51
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w.king124

金虫 (正式写手)
★
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我用的是Taraka的pmd18T载体，很少有自连的情况
如果是做单酶切的话肯定得做去磷酸化，双酶切基本不用吧
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6楼2009-07-10 21:41:42
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):鼓励一下！ 7-11 18:39
连T载体一般不会出现自连的情况,可用蓝白斑筛选
连表达载体的时候有时会出现自连,我也经常遇到过,多切多连总会遇到成功的
去磷酸化,有时也会自连的,我曾做过去磷酸化,基本没什么效果,可能是技术问题吧,后来还是按常规方法做
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7楼2009-07-11 16:17:19
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
平端是自连的概率大
黏端可能是根本没切开
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8楼2009-07-11 16:43:00
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0):鼓励一下！ 7-11 18:39
市面所受T-vector多数都是在lac_Z处使用平端酶处理，然后加T，这种做法并不能保证所有的线性分子都加上这个T，而且多次冻融同样可以失T，因此自联多有发生，现在在大肠杆菌中已有一种致死基因的筛选系统，国内的代用品不知道是否已开发出来，如果有将是做常规克隆的一大幸事，表达载体自联，关键是看你用的是什么酶，它的切点如何，切割是否完全，
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9楼2009-07-11 18:12:41
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
学习了。谢谢楼上各位。
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Thank-you，so-blue.
10楼2009-07-12 17:35:36
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