| 查看: 1572 | 回复: 3 | |||
[交流]
克隆某未知基因片段，高保真酶仍然遇到突变并改变氨基酸，就问怎么办 已有3人参与
|
|
基因克隆新手求助： 我最近想要研究某个昆虫的基因，由于并非模式生物，没有任何之前研究，唯一可以用的reference就是组学拼接data。设计引物扩增长度大约1500bp，共2个片段，从cDNA文库中扩增，一开始用LA Taq，后来在某合作者（PI）建议下用高保真酶又做了一次。高保真酶是NEB的Q5高保真酶（从未开封但在负20度放置了3年），用普通Taq加A。克隆载体用的是pGEM-T Easy，感受态自制DH5a。 结果是片段1，LA扩增产物连接挑到1个好的克隆，Q5挑到2个。序列完全一样，但是对比reference却发现有5个位点不同。大致效果如下： FG1: Ref: G C A T LA-11: A T C C q5-01: A T C C q5-03: A T C C 片段2，仅用了Q5高保真酶，挑了3个克隆，但却发现这三个克隆彼此和reference都有较多区别，其中2个氨基酸发生改变。 Ref: G A A C A Q2: A G A T G Q3: A G G T A Q4: A G A T A 我的目的是连接两条片段并进行表达，因此序列正确与否十分重要。请问 1. FG1的三个克隆序列都一致且来源于不同PCR体系，是否可以认为其序列是正确的，而reference的结果需要修正？ 2. FG2三个克隆和reference序列不同且彼此都不同，该如何解决？差异到底是PCR突变还是reference本身问题。 谢谢！！！ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有125人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
世外清风
铁杆木虫 (职业作家)
- 应助: 63 (初中生)
- 贵宾: 0.082
- 金币: 8956.3
- 散金: 1169
- 红花: 12
- 帖子: 3145
- 在线: 873.9小时
- 虫号: 714541
- 注册: 2009-03-04
- 性别: GG
- 专业: 动物遗传学
2楼2020-03-14 08:44:26
3楼2020-03-15 22:28:24
匿名
用户注销 (正式写手)
- 应助: 128 (高中生)
- 金币: 4550.4
- 散金: 50
- 红花: 22
- 帖子: 934
- 在线: 645.1小时
- 虫号: 0
- 注册: 2011-10-17
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
4楼2020-03-18 17:29:03
