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克隆某未知基因片段，高保真酶仍然遇到突变并改变氨基酸，就问怎么办 已有3人参与
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基因克隆新手求助： 我最近想要研究某个昆虫的基因，由于并非模式生物，没有任何之前研究，唯一可以用的reference就是组学拼接data。设计引物扩增长度大约1500bp，共2个片段，从cDNA文库中扩增，一开始用LA Taq，后来在某合作者（PI）建议下用高保真酶又做了一次。高保真酶是NEB的Q5高保真酶（从未开封但在负20度放置了3年），用普通Taq加A。克隆载体用的是pGEM-T Easy，感受态自制DH5a。 结果是片段1，LA扩增产物连接挑到1个好的克隆，Q5挑到2个。序列完全一样，但是对比reference却发现有5个位点不同。大致效果如下： FG1: Ref: G C A T LA-11: A T C C q5-01: A T C C q5-03: A T C C 片段2，仅用了Q5高保真酶，挑了3个克隆，但却发现这三个克隆彼此和reference都有较多区别，其中2个氨基酸发生改变。 Ref: G A A C A Q2: A G A T G Q3: A G G T A Q4: A G A T A 我的目的是连接两条片段并进行表达，因此序列正确与否十分重要。请问 1. FG1的三个克隆序列都一致且来源于不同PCR体系，是否可以认为其序列是正确的，而reference的结果需要修正？ 2. FG2三个克隆和reference序列不同且彼此都不同，该如何解决？差异到底是PCR突变还是reference本身问题。 谢谢！！！ |
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