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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切连接4个星期一直没成功，求助
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wfmgood

银虫 (小有名气)

[交流] 酶切连接4个星期一直没成功，求助

设计引物
上游引物：Primer1 5’-CGggatccGGACCATGACCATGACCCTC-3’     Tm=70.8℃
                                        BamHⅠ
下游引物：Primer2 5’-CCGgaattcTCAGACTGTGGCAGGGAAAC-3’    Tm=67.7℃
                                         EcoRⅠ
用高保真酶扩增目的基因1800bp，电泳鉴定扩增条带大小无误，然后胶回收后双酶切，电泳后再胶回收目的基因；同时BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pcDNA3.1(+)胶回收；试着目的基因和载体以不同的比例进行连接，16度过夜转化感受态细胞，涂板，菌落PCR鉴定阳性克隆，我一般挑40个克隆结果全部是阴性，做了好多次都是这样，很是郁闷，请高手指点一下问题可能出在什么地方？非常感谢
是不是我设计的引物加的保护碱基不对？
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1楼 2009-06-21 22:30:13
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)

优秀区长优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个领域我就不懂了，帮顶！
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如果没有人帮助你，那么你就去帮助别人。
2楼2009-06-21 22:50:15
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
那就先克隆到T载体上面再进行双酶切，再连接。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2009-06-21 22:58:51
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study236

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我一般加四个保护碱基，根据你设计引物的gc含量随便加，一般保证gc含量为50%左右，
会不会是你挑选阳性克隆后，摇菌时除了差错啊？LB培养基中又没有加相应的的抗生素
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4楼2009-06-21 23:06:28
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cauzhangtao

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个玩意是不是考虑换酶了啊
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5楼2009-06-21 23:11:38
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mourning

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我也做了好久得克隆，一直自连严重，用去磷酸化也无济
LZ你要检查体系的所有因素，酶啊，菌啊，可叫别人帮重复看看
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6楼2009-06-21 23:48:36
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miller211

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个我不懂了，帮顶吧~~

我是直接用生物公司买的酶切的，而且是直接用pcr产物接着酶切的。。
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7楼2009-06-22 01:05:55
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可能是保护碱基数偏少，建议连到t载体上，再切
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8楼2009-06-22 06:06:07
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anik

银虫 (正式写手)
想着省事，却是欲速则不达。为何不连到T在载体上？PCR产物直接酶切效果能够保证的了么？PCR产物直接酶切，酶切识别位点前面通常都是4-5个碱基的。
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9楼2009-06-22 08:09:49
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
换NEB酶
BamHI EcoR1的效率都是很高的，我们连接完了根本都不需要筛选，直接送测序
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10楼2009-06-22 08:23:35
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