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wfmgood银虫 (小有名气)
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酶切连接4个星期一直没成功，求助
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设计引物 上游引物：Primer1 5’-CGggatccGGACCATGACCATGACCCTC-3’ Tm=70.8℃ BamHⅠ 下游引物：Primer2 5’-CCGgaattcTCAGACTGTGGCAGGGAAAC-3’ Tm=67.7℃ EcoRⅠ 用高保真酶扩增目的基因1800bp，电泳鉴定扩增条带大小无误，然后胶回收后双酶切，电泳后再胶回收目的基因；同时BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切载体pcDNA3.1(+)胶回收；试着目的基因和载体以不同的比例进行连接，16度过夜转化感受态细胞，涂板，菌落PCR鉴定阳性克隆，我一般挑40个克隆结果全部是阴性，做了好多次都是这样，很是郁闷，请高手指点一下问题可能出在什么地方？非常感谢 是不是我设计的引物加的保护碱基不对？ |
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