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求学1

新虫 (小有名气)

[求助] pcp20质粒转化 已有3人参与

求助各位大神,red同源重组后,转化pcp20质粒到大肠去除km抗性,但是一直都转不进去,电转和热激都尝试了,都不行,不知道什么原因,请各位大神施于援手

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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先确定质粒有没有问题(是否是pCP20,浓度有多高),另外转化后复苏和涂板的抗性和温度是否有问题,转化pKD46效率低的倒是有,pCP20转化率低的挺少的。
2楼2020-01-02 17:59:42
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
3楼2020-01-02 18:00:52
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


crispr敲除会比较方便快捷

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4楼2020-01-02 21:11:49
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求学1

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 雨独步 at 2020-01-02 17:59:42
首先确定质粒有没有问题(是否是pCP20,浓度有多高),另外转化后复苏和涂板的抗性和温度是否有问题,转化pKD46效率低的倒是有,pCP20转化率低的挺少的。

怀疑质粒有过问题,就转了T1做对照,一点问题都没有,也怕涂板有问题,玻璃珠和玻璃棒都有做对照,也没有问题,复苏基本上就是30℃,1-2小时,感觉哪里都没问题,就是转不进去,非常感谢回复

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5楼2020-01-03 08:44:48
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求学1

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小木无虫 at 2020-01-02 18:00:52
尝试用Cas9系统做吧,挺方便的

嗯嗯,但是之前做过,效果不好,就用了red系统,谢谢

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6楼2020-01-03 08:45:34
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KM石头

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我觉得楼主可以考虑试剂纯度的问题,转化时试剂纯度不够,可能会影响转化效率。还有水,用好一点的水,可以试试哇哈哈。使用的玻璃器皿要干净,清洗完成后使用超声清洗,再自然晾干

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7楼2020-01-04 14:30:49
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求学1

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by KM石头 at 2020-01-04 14:30:49
我觉得楼主可以考虑试剂纯度的问题,转化时试剂纯度不够,可能会影响转化效率。还有水,用好一点的水,可以试试哇哈哈。使用的玻璃器皿要干净,清洗完成后使用超声清洗,再自然晾干
...

好的,非常感谢

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8楼2020-01-04 15:24:48
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85888888

铁虫 (初入文坛)

请问还有pCP20质粒么,我现在也在做red重组
9楼2021-12-16 09:43:02
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donkey2014

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 85888888 at 2021-12-16 09:43:02
请问还有pCP20质粒么,我现在也在做red重组

我有pCP20质粒,需要可以私信
10楼2021-12-17 06:45:03
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