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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » pcp20质粒转化
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求学1

新虫 (小有名气)

[求助] pcp20质粒转化 已有3人参与

求助各位大神，red同源重组后，转化pcp20质粒到大肠去除km抗性，但是一直都转不进去，电转和热激都尝试了，都不行，不知道什么原因，请各位大神施于援手

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1楼 2020-01-02 14:39:38
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先确定质粒有没有问题（是否是pCP20，浓度有多高），另外转化后复苏和涂板的抗性和温度是否有问题，转化pKD46效率低的倒是有，pCP20转化率低的挺少的。
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2楼2020-01-02 17:59:42
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
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3楼2020-01-02 18:00:52
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
crispr敲除会比较方便快捷

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4楼2020-01-02 21:11:49
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求学1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 雨独步 at 2020-01-02 17:59:42
首先确定质粒有没有问题（是否是pCP20，浓度有多高），另外转化后复苏和涂板的抗性和温度是否有问题，转化pKD46效率低的倒是有，pCP20转化率低的挺少的。

怀疑质粒有过问题，就转了T1做对照，一点问题都没有，也怕涂板有问题，玻璃珠和玻璃棒都有做对照，也没有问题，复苏基本上就是30℃，1-2小时，感觉哪里都没问题，就是转不进去，非常感谢回复

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5楼2020-01-03 08:44:48
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求学1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小木无虫 at 2020-01-02 18:00:52
尝试用Cas9系统做吧，挺方便的

嗯嗯，但是之前做过，效果不好，就用了red系统，谢谢

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6楼2020-01-03 08:45:34
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KM石头

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得楼主可以考虑试剂纯度的问题，转化时试剂纯度不够，可能会影响转化效率。还有水，用好一点的水，可以试试哇哈哈。使用的玻璃器皿要干净，清洗完成后使用超声清洗，再自然晾干

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7楼2020-01-04 14:30:49
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求学1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by KM石头 at 2020-01-04 14:30:49
我觉得楼主可以考虑试剂纯度的问题，转化时试剂纯度不够，可能会影响转化效率。还有水，用好一点的水，可以试试哇哈哈。使用的玻璃器皿要干净，清洗完成后使用超声清洗，再自然晾干
...

好的，非常感谢

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8楼2020-01-04 15:24:48
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85888888

铁虫 (初入文坛)
请问还有pCP20质粒么，我现在也在做red重组
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9楼2021-12-16 09:43:02
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donkey2014

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 85888888 at 2021-12-16 09:43:02
请问还有pCP20质粒么，我现在也在做red重组

我有pCP20质粒，需要可以私信
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10楼2021-12-17 06:45:03
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