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质粒宝

银虫 (小有名气)

[交流] sgRNA构建建议教程 已有1人参与

sgRNA构建建议教程

1，        引物设计，https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/；
2，        引物退火，引物稀释到20nM，正反向引物分别取10ul混合，取0.5-1L水加热到沸腾，混合后引物放入，自然冷却到室温（2-4小时）；
3，        酶切连接，取200ng质粒（不用太多，减少自连），取5ul退火的引物，T4连接酶和内切酶10×bufffer分别取0.5ul，ddH2O补到10ul
4，        PCR仪器设置程序（时间紧张可以减少循环数或者减少循环内时间）
1)，37℃   5min

2)，37℃   5min
3)，16℃   10min
第2,3步15-20个循环
4)，16℃   10min
5，        产物用于转化；
6，        PCR检测，用sgRNA引物，配合载体上引物PCR检测；
7，        送测序
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  • 附件 1 : sgRNA构建建议教程.docx
    • 2019-12-05 09:35:48, 84.52 K

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1楼 2019-12-05 09:35:49
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f1789954073y

新虫 (小有名气)
感谢楼主

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2楼2020-05-14 22:51:16
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f1789954073y

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最近也在做sg构建

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3楼2020-05-14 22:51:40
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