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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组酵母表达问题
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云是天空白

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组酵母表达问题

各位大佬，小弟目前正在用毕赤酵母做组成型的表达菌株，出发菌株用的GS115（SMD1168、X33等也试过），质粒载体用的pPIC9K，方法是用GAP启动子基因序列将9K上的AOX1启动子序列替换掉（从SacⅠ酶切位点开始到BamHⅠ结束全部替换），延用a-MF信号肽，后面紧跟着我的目的蛋白，构建后选用SalⅠ或BglⅡ酶进行线性化电转至GS115酵母中，开始做时SDS电泳，以及WB检测都成功了，液相也跑了，各种检测结果都是正确的。现在出现了一个问题，构建后的相同一管的质粒无论用什么酶线性化，或者转至哪一种酵母，经过抗性筛选再转至G418平板后挑取的单克隆都无法表达目的蛋白了。目前最近的一次实验尝试了直接挑取MD平板上的，和转涂至G418上的菌株，发现MD上的能够表达，而G418上的单克隆无法表达。望各位前辈大佬不吝赐教！拜谢各位了
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1楼2019-11-28 10:28:08
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-11-30 22:38:48
质粒发生了自我重组

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2楼2019-11-28 13:33:48
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Acov

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2019-11-28 13:33:48
质粒发生了自我重组

那该怎么解决好

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3楼2019-11-30 01:32:49
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15845856241

新虫 (小有名气)
对质粒去磷酸化？

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4楼2020-12-18 15:03:39
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