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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组酵母表达问题
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云是天空白

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组酵母表达问题 已有1人参与

各位大佬，小弟目前正在用毕赤酵母做组成型的表达菌株，出发菌株用的GS115（SMD1168、X33等也试过），质粒载体用的pPIC9K，方法是用GAP启动子基因序列将9K上的AOX1启动子序列替换掉（从SacⅠ酶切位点开始到BamHⅠ结束全部替换），延用a-MF信号肽，后面紧跟着我的目的蛋白，构建后选用SalⅠ或BglⅡ酶进行线性化电转至GS115酵母中，开始做时SDS电泳，以及WB检测都成功了，液相也跑了，各种检测结果都是正确的。现在出现了一个问题，构建后的相同一管的质粒无论用什么酶线性化，或者转至哪一种酵母，经过抗性筛选再转至G418平板后挑取的单克隆都无法表达目的蛋白了。目前最近的一次实验尝试了直接挑取MD平板上的，和转涂至G418上的菌株，发现MD上的能够表达，而G418上的单克隆无法表达。望各位前辈大佬不吝赐教！拜谢各位了
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1楼 2019-11-28 10:28:08
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-11-30 22:38:48
质粒发生了自我重组

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2楼2019-11-28 13:33:48
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Acov

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2019-11-28 13:33:48
质粒发生了自我重组

那该怎么解决好

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3楼2019-11-30 01:32:49
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15845856241

新虫 (小有名气)
对质粒去磷酸化？

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4楼2020-12-18 15:03:39
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Epiphany_I

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

您好，我想来询问一下毕赤酵母再MD平板上筛选的问题。我用的是ppic9k和gs115菌株，也差不多做了5次电转了，但是涂在MD平板上就是不长斑，转的ppic9k空载也不长，不知道是哪里出了问题，所以想来问一下你这个问题最后解决了吗？有什么别的方法？我是gs115到od＝1.0左右就制备感受态了，用的pme I线性化载体，用乙醇沉淀法回收DNA，然后转了大概5ug的载体进感受态细胞，电转条件是1500V，25μF，200Ω，2mm电转，电转过后显示4.9ms和1491V，感觉都挺完美的但是就是在MD平板上长不起来。我试过三种方法，一个是电转后加山梨醇后马上涂板，第二种是加完山梨醇30度静置1h后涂板，第三个是静置1h后放去30℃摇床复苏1h后再涂板，这三种方法都没能在MD平板上长起来，所以我想来请教一下，感谢！
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5楼2024-11-03 18:02:15
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