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重组酵母表达问题
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 各位大佬，小弟目前正在用毕赤酵母做组成型的表达菌株，出发菌株用的GS115（SMD1168、X33等也试过），质粒载体用的pPIC9K，方法是用GAP启动子基因序列将9K上的AOX1启动子序列替换掉（从SacⅠ酶切位点开始到BamHⅠ结束全部替换），延用a-MF信号肽，后面紧跟着我的目的蛋白，构建后选用SalⅠ或BglⅡ酶进行线性化电转至GS115酵母中，开始做时SDS电泳，以及WB检测都成功了，液相也跑了，各种检测结果都是正确的。现在出现了一个问题，构建后的相同一管的质粒无论用什么酶线性化，或者转至哪一种酵母，经过抗性筛选再转至G418平板后挑取的单克隆都无法表达目的蛋白了。目前最近的一次实验尝试了直接挑取MD平板上的，和转涂至G418上的菌株，发现MD上的能够表达，而G418上的单克隆无法表达。望各位前辈大佬不吝赐教！拜谢各位了 |
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