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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 随机突变，目的片段如何与pET-28a连接的多些
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wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 随机突变，目的片段如何与pET-28a连接的多些

如题，本人想做随机突变，先通过易错PCR，扩增得到随机突变的目的片段，然后双酶切（NdeI和HindIII），之后与用同样的内切酶酶切的pET-28a相连，试了好多次，都无一成功。推测原因可能是目的片段很难双酶切成功。
所以借此宝地，向各位高手请教，您们是如何解决这个难题的！望大虾们不吝赐教。
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1楼 2009-06-09 12:53:01
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jdklgjldg

木虫 (正式写手)
看你目的片段的大小，一般片段过大连接的效率就低，连接的时间就要长一些。检查下自己的连接酶和buffer是否有问题。选择的酶切位点是否有问题，是否利于连接。
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我的目标:诺贝尔医学与生理学奖
2楼2009-06-09 13:30:52
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
可以先连T载体，或者在设计引物时在两端多加几个保护碱基。
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3楼2009-06-09 14:25:47
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
同楼上，多花点钱，先连T，连T后比用pcr产物直接酶切更容易切出粘性末端。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-06-09 16:07:47
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bbyu007

木虫 (正式写手)
用高保真酶扩，然后连T（Blunt）。没问题！做吧！没有构建不好的载体！
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我是笨笨鱼~~~
5楼2009-06-09 16:43:59
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★
wh7690703(金币+1,VIP+0):我的NdeI保护碱基加了5个，HindIII加了3个，直接酶切发现很难切断。兄弟，有好的办法吗？ 6-9 22:30
wh7690703(金币+1,VIP+0): 6-9 22:30
wh7690703(金币+1,VIP+0):我的NdeI保护碱基加了5个，HindIII加了3个，直接酶切发现很难切断。兄弟，有好的办法吗？ 6-9 22:31
wh7690703(金币+1,VIP+0):NdeI加了5个保护碱基，HindIII加了3个。兄弟，有好的办法吗？ 6-9 22:31
双酶切显然是首选，先连到T载体不但要增加操作还可能损失库容量
NdeI需要加入至少6个保护碱基,常用的HindIII也要三个
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6楼2009-06-09 18:11:48
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wh7690703

木虫 (正式写手)
连T当然容易了，关键是筛库的时候，会不会减少库容量啊，而且连T操作起来既麻烦又费时。
基于此，才在此向大虾们求助。
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7楼2009-06-09 22:33:48
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wh7690703

木虫 (正式写手)
怎么没人理睬啊
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8楼2009-06-10 01:04:26
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢积极参与！ 6-10 10:32
puc18/19系列，连t后出单菌落，直接用m13引物pcr看是否有大片段（大于150b），连蓝白斑都不用做，相当方便。
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9楼2009-06-10 07:37:12
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
重新设计引物，补足保护碱基试试吧
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10楼2009-06-10 08:12:50
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