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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 随机突变，目的片段如何与pET-28a连接的多些
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2008116068

木虫 (著名写手)
双酶切：先加一个酶，等完全切开了，在加另一个酶。
切不开的时候，我们就做，效果还行，就是麻烦了一些
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只要踮起脚尖，就离太阳更近一点！！！
11楼2009-06-11 08:11:45
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
★
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢，保护碱基都加了，感受态没问题 6-12 12:18
LZ是做文库筛选吧，建议看一看文库筛选方面的书。
一点建议：
先将载体连入一片断后做双酶切，切胶回收载体，保证载体切透，降低假阳性。

目的片断的引物应引入合适的酶切位点，当然加上适当的保护碱基。

连接体系的确立，通过预实验得出外源与载体的连接比率。

感受态的性能。
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12楼2009-06-12 00:05:31
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
是不是连接的时间太短，试试多连一会吧
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平和悦衲！
13楼2009-06-12 09:23:38
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
★
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢，我用的TAKARA的内切酶，50ul体系，加了2ul内切酶，酶切时间12h。不知够否？ 6-12 12:17
一般3个保护性碱基都够用了，这两个酶我都用过量都只都加了三个保护性碱基，直接就连进行去了，我用的是NEB的酶，如果楼主觉得不好切的话加大酶量延长酶切时间就可以了。
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14楼2009-06-12 09:24:48
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wh7690703

木虫 (正式写手)
谢谢各位大侠，我是打算建库的，若目的片段与载体无法连接，则无法进行下一步实验啊
小弟在此恳请大家多建言献策。
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15楼2009-06-12 12:20:37
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loveedward

银虫 (小有名气)
★
wh7690703(金币+1,VIP+0):缓冲液当然是用的通用buffer，连接转化应该都没问题，感受态也没问题。每部都是做了对照的 6-14 18:34
建议你先将目的基因片段连接到T载体上，这样目的基因两段有比较多的碱基，相对直接将目的基因进行双酶切来说要容易的多。还有就是你应该查一下两种酶所用的缓冲体系是不是一样的。最好选择一样的缓冲体系。第三，就是Nod1这个酶的酶切效率比较低，我以前用过这个酶，酶切的时间较其他的没来说比较长。这也可能是你失败的一个原因。最后就是你必须确定你连接的所有东西全部没有问题，才能确定问题出现在酶切上。
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16楼2009-06-14 17:30:11
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