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2008116068

木虫 (著名写手)

双酶切:先加一个酶,等完全切开了,在加另一个酶。
切不开的时候,我们就做,效果还行,就是麻烦了一些
只要踮起脚尖,就离太阳更近一点!!!
11楼2009-06-11 08:11:45
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)


wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢,保护碱基都加了,感受态没问题 6-12 12:18
LZ是做文库筛选吧,建议看一看文库筛选方面的书。
一点建议:
先将载体连入一片断后做双酶切,切胶回收载体,保证载体切透,降低假阳性。

目的片断的引物应引入合适的酶切位点,当然加上适当的保护碱基。

连接体系的确立,通过预实验得出外源与载体的连接比率。

感受态的性能。
12楼2009-06-12 00:05:31
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛~

是不是连接的时间太短,试试多连一会吧
平和悦衲!
13楼2009-06-12 09:23:38
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)


wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢,我用的TAKARA的内切酶,50ul体系,加了2ul内切酶,酶切时间12h。不知够否? 6-12 12:17
一般3个保护性碱基都够用了,这两个酶我都用过量都只都加了三个保护性碱基,直接就连进行去了,我用的是NEB的酶,如果楼主觉得不好切的话加大酶量延长酶切时间就可以了。
14楼2009-06-12 09:24:48
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wh7690703

木虫 (正式写手)

谢谢各位大侠,我是打算建库的,若目的片段与载体无法连接,则无法进行下一步实验啊
小弟在此恳请大家多建言献策。
15楼2009-06-12 12:20:37
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loveedward

银虫 (小有名气)


wh7690703(金币+1,VIP+0):缓冲液当然是用的通用buffer,连接转化应该都没问题,感受态也没问题。每部都是做了对照的 6-14 18:34
建议你先将目的基因片段连接到T载体上,这样目的基因两段有比较多的碱基,相对直接将目的基因进行双酶切来说要容易的多。还有就是你应该查一下两种酶所用的缓冲体系是不是一样的。最好选择一样的缓冲体系。第三,就是Nod1这个酶的酶切效率比较低,我以前用过这个酶,酶切的时间较其他的没来说比较长。这也可能是你失败的一个原因。最后就是你必须确定你连接的所有东西全部没有问题,才能确定问题出现在酶切上。
16楼2009-06-14 17:30:11
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