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wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 随机突变,目的片段如何与pET-28a连接的多些

如题,本人想做随机突变,先通过易错PCR,扩增得到随机突变的目的片段,然后双酶切(NdeI和HindIII),之后与用同样的内切酶酶切的pET-28a相连,试了好多次,都无一成功。推测原因可能是目的片段很难双酶切成功。
所以借此宝地,向各位高手请教,您们是如何解决这个难题的!望大虾们不吝赐教。
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)


wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢,我用的TAKARA的内切酶,50ul体系,加了2ul内切酶,酶切时间12h。不知够否? 6-12 12:17
一般3个保护性碱基都够用了,这两个酶我都用过量都只都加了三个保护性碱基,直接就连进行去了,我用的是NEB的酶,如果楼主觉得不好切的话加大酶量延长酶切时间就可以了。
14楼2009-06-12 09:24:48
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jdklgjldg

木虫 (正式写手)

看你目的片段的大小,一般片段过大连接的效率就低,连接的时间就要长一些。检查下自己的连接酶和buffer是否有问题。选择的酶切位点是否有问题,是否利于连接。
我的目标:诺贝尔医学与生理学奖
2楼2009-06-09 13:30:52
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

可以先连T载体,或者在设计引物时在两端多加几个保护碱基。
3楼2009-06-09 14:25:47
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

同楼上,多花点钱,先连T,连T后比用pcr产物直接酶切更容易切出粘性末端。
Thank-you,so-blue.
4楼2009-06-09 16:07:47
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