24小时热门版块排行榜    

查看: 1234  |  回复: 15
当前主题已经存档。
【有奖交流】积极回复本帖子,参与交流,就有机会分得作者 wh7690703 的 2 个金币
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 随机突变,目的片段如何与pET-28a连接的多些

如题,本人想做随机突变,先通过易错PCR,扩增得到随机突变的目的片段,然后双酶切(NdeI和HindIII),之后与用同样的内切酶酶切的pET-28a相连,试了好多次,都无一成功。推测原因可能是目的片段很难双酶切成功。
所以借此宝地,向各位高手请教,您们是如何解决这个难题的!望大虾们不吝赐教。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveedward

银虫 (小有名气)


wh7690703(金币+1,VIP+0):缓冲液当然是用的通用buffer,连接转化应该都没问题,感受态也没问题。每部都是做了对照的 6-14 18:34
建议你先将目的基因片段连接到T载体上,这样目的基因两段有比较多的碱基,相对直接将目的基因进行双酶切来说要容易的多。还有就是你应该查一下两种酶所用的缓冲体系是不是一样的。最好选择一样的缓冲体系。第三,就是Nod1这个酶的酶切效率比较低,我以前用过这个酶,酶切的时间较其他的没来说比较长。这也可能是你失败的一个原因。最后就是你必须确定你连接的所有东西全部没有问题,才能确定问题出现在酶切上。
16楼2009-06-14 17:30:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

jdklgjldg

木虫 (正式写手)

看你目的片段的大小,一般片段过大连接的效率就低,连接的时间就要长一些。检查下自己的连接酶和buffer是否有问题。选择的酶切位点是否有问题,是否利于连接。
我的目标:诺贝尔医学与生理学奖
2楼2009-06-09 13:30:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

可以先连T载体,或者在设计引物时在两端多加几个保护碱基。
3楼2009-06-09 14:25:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

同楼上,多花点钱,先连T,连T后比用pcr产物直接酶切更容易切出粘性末端。
Thank-you,so-blue.
4楼2009-06-09 16:07:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +5 zju2000 2026-08-16 5/250 2026-08-16 23:23 by Haru815
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +32 医学老男孩 2026-08-13 74/3700 2026-08-16 21:05 by 医学老男孩
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +9 Ldrop2023 2026-08-13 9/450 2026-08-16 13:24 by wukun_007
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +11 家与远方 2026-08-10 16/800 2026-08-16 10:28 by ray43
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] filecode +8 cratir 2026-08-14 12/600 2026-08-15 18:08 by zyfgau
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
信息提示
请填处理意见