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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增一直失败
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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夏夏Dana

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩增一直失败 已有1人参与

1、筛选到的菌株，NCBI鉴定菌种类型，最大相似度到达92%，查找目的基因根据ORF框设计引物，目标片段1400多bp，一直扩增不出来。
2、一个菌株中，编码同一个酶的基因有三种，仅扩增出一个，另外两个一直扩增失败。
请问如何优化?
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1楼 2019-10-21 19:54:34
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夏夏Dana

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by woshishui916 at 2019-10-21 21:15:12
买的mix扩的吧？

用过mix，也用过自己加的
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5楼2019-10-25 14:54:57
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woshishui916

木虫 (著名写手)
买的mix扩的吧？

发自小木虫Android客户端
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2楼2019-10-21 21:15:12
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zg14151

新虫 (正式写手)
基因组测序，再根据测序结果设计引物扩增

发自小木虫Android客户端
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3楼2019-10-22 14:34:16
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猴普夫尔

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你好，根据你的描述，我建议你首先检查引物。
可以使用NCBI的primer-BLAST来评价你设计的引物是否足够好。
如果引物的特异性没有问题，并且不存在形成引物二聚体的问题，那么你需要考虑你是否使用了适合你引物的退火温度。
一对好的引物，它们的Tm相差不大于5，并且GC含量相似（如果你加了限制性酶切位点，也要考虑进去）。一般的退火温度是引物的Tm－5。
其次，你还需要检查延伸时间。根据不同的聚合酶，它们的扩增速度不同，你需要根据你的目的片段的长度调整延伸时间。以上两点可以参考你使用的聚合酶说明书来进行调整。
如果你有阳性对照的话（即提取自你BLAST匹配到的菌种的DNA），还可以试着做一个温度梯度PCR，来测试不同的退火温度，选择其中更适合你的引物的条件。

此外，你说到“编码同一个酶的基因有三种，仅扩增出一个”，意思是同一个物种当中有三个等位基因？
它们的CDS序列两端一样吗？如果不一样需要根据不同的基因设计不同的引物。

预祝你成功。
有问题欢迎继续交流
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夏夏Dana
向着太阳生长
4楼2019-10-23 20:01:55
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