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PCR扩增一直失败 已有1人参与
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1、筛选到的菌株，NCBI鉴定菌种类型，最大相似度到达92%，查找目的基因根据ORF框设计引物，目标片段1400多bp，一直扩增不出来。 2、一个菌株中，编码同一个酶的基因有三种，仅扩增出一个，另外两个一直扩增失败。 请问如何优化? |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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楼主你好，根据你的描述，我建议你首先检查引物。 可以使用NCBI的primer-BLAST来评价你设计的引物是否足够好。 如果引物的特异性没有问题，并且不存在形成引物二聚体的问题，那么你需要考虑你是否使用了适合你引物的退火温度。 一对好的引物，它们的Tm相差不大于5，并且GC含量相似（如果你加了限制性酶切位点，也要考虑进去）。一般的退火温度是引物的Tm－5。 其次，你还需要检查延伸时间。根据不同的聚合酶，它们的扩增速度不同，你需要根据你的目的片段的长度调整延伸时间。以上两点可以参考你使用的聚合酶说明书来进行调整。 如果你有阳性对照的话（即提取自你BLAST匹配到的菌种的DNA），还可以试着做一个温度梯度PCR，来测试不同的退火温度，选择其中更适合你的引物的条件。 此外，你说到“编码同一个酶的基因有三种，仅扩增出一个”，意思是同一个物种当中有三个等位基因？ 它们的CDS序列两端一样吗？如果不一样需要根据不同的基因设计不同的引物。 预祝你成功。  有问题欢迎继续交流 |
夏夏Dana
4楼2019-10-23 20:01:55
woshishui916
木虫 (著名写手)
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2楼2019-10-21 21:15:12
3楼2019-10-22 14:34:16
5楼2019-10-25 14:54:57
