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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 化学分析 » RCA滚环扩增中用到的酶的问题
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炸鱼条yy

新虫 (初入文坛)

[求助] RCA滚环扩增中用到的酶的问题 已有1人参与

我看到都是用phi29这种酶来做滚还扩增，用KF聚合酶可以做吗，以及这两种酶之间有什么区别？有做过的前辈可以分享一下吗。
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1楼 2019-10-08 16:37:34
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历历文

新虫 (初入文坛)
请问，RCA产物跑0.5%的琼脂糖，都留在孔道中，还有长长的拖尾，这是为什么

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7楼2020-10-12 20:12:27
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Tiriosh

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
除了一般的DNA聚合外，RCA最大的特点是需要聚合酶持续的把之前生成的双开“顶开”，也就是说需要具有strand displacement性能。根据NEB官网信息，KF是Moderate strand displacement activity，感觉应该可以做RCA但是可能效率会有影响。与之相对，phi29是strong strand displacement activity。

做RCA用的酶，除了strand displacement性能之外还会考虑exonuclease activity性能，是否具备这一性能对于RCA的实验细节有影响。KF不具备外切酶活性（以NEB官网说明为准，来源不同话可能性能有所不同）那么对primer的处理就需要保证其3'端是结核在circular tempalte上，通常的做法是用外切酶trim一下，这也要看你的实验设计咯。

此外，phi29的一个很大的问题是其最适温度是30°，所以反应速度会慢一些。如果你是处于提高反应温度考虑而换酶的话，推荐你使用EquiPhi29，是phi29的热稳定版。
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炸鱼条yy
2楼2019-10-08 20:48:04
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SX花开有声

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Tiriosh at 2019-10-08 13:48:04
除了一般的DNA聚合外，RCA最大的特点是需要聚合酶持续的把之前生成的双开“顶开”，也就是说需要具有strand displacement性能。根据NEB官网信息，KF是Moderate strand displacement activity，感觉应该可以做RCA但是 ...

想问一下vent聚合酶可以吗
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3楼2019-10-09 09:08:34
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Tiriosh

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SX花开有声 at 2019-10-09 09:08:34
想问一下vent聚合酶可以吗...

最早一篇primer generation RCA (08年发表于NAR)用的就是vent

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4楼2019-10-09 14:53:14
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