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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】玉米cDNA长片段扩增问题
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weeqiang

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助】玉米cDNA长片段扩增问题

在NCBI上找到了该基因的mRNA全长，根据全长设计了引物，全长2500bp，提取了RNA反转录为cDNA进行扩增，摸索了很多条件总是扩不出来，一点条带都看不到，这个基因的的表达量很低，也不知道有些什么问题，希望能得到各位虫友的帮助，我是新手有些都不是很懂....

[ Last edited by amisking on 2009-6-1 at 13:24 ]
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1楼 2009-05-31 21:24:29
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350784478

木虫 (正式写手)
★
weeqiang(金币+1,VIP+0):非常感谢 6-1 13:22
我也遇到和你一样的问题，你要是还扩增不出来，那就找其他人帮你提取一下。我的情况就是这样，提取mRNA都挺好的，但是就是扩增不出PCR产物，最后我找了其他人帮我提了一次，然后也用她的试剂帮我跑了一次PCR,结果就出来了，你可以试一下。
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朝为田舍郎，暮登天子堂。将相本无种，男儿当自强。
2楼2009-05-31 22:37:38
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ilaveu

木虫 (著名写手)
确实，实验有偶然性，找个实验高手代你做一下可能会出来
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3楼2009-05-31 23:10:05
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weeqiang

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 350784478 at 2009-5-31 22:37:
我也遇到和你一样的问题，你要是还扩增不出来，那就找其他人帮你提取一下。我的情况就是这样，提取mRNA都挺好的，但是就是扩增不出PCR产物，最后我找了其他人帮我提了一次，然后也用她的试剂帮我跑了一次PCR,结果 ...

会不会和表达量有关呢？
我用的酶是LA
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4楼2009-06-01 13:22:04
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Milanmy

银虫 (小有名气)
★
weeqiang(金币+1,VIP+0):谢谢，我就是用的这个公司的反转录试剂盒，根据文献介绍我取的部位应该是有表达的，就是表达量非常低！还有就是长片段会不会不好扩 6-1 13:37
首先你得确定它在你提取RNA的组织中是表达的，其它就是RNA的提取质量，反转录酶的效率了，如果表达量很低的话，有条件就用Invitrogen的superscript III，这个酶是反转录效率最高的，其它的酶效率要差很多。
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5楼2009-06-01 13:26:37
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
weeqiang(金币+1,VIP+0):谢谢 6-2 13:39
建议你计算一下是否是GC含量高，有时候GC含量高对用的酶有一定的特殊要求，至于长度2.5K不算长的。还有退火温度是不是找对了，如果温度不对做个梯度吧。扩不出来最先找温度的问题。
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6楼2009-06-01 14:40:38
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
weeqiang(金币+1,VIP+0):谢谢 6-2 13:39
还有建议你反转录酶选择，如果GC含量高建议你用AMV类型的反转录酶，如果更注重扩全长建议你用M-MLV类型的反转录酶。
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7楼2009-06-01 14:43:40
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guyue2885

银虫 (正式写手)
梯度PCR吧温度给确定好吧~~bless
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8楼2009-06-01 16:10:52
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Milanmy

银虫 (小有名气)
★
amisking(金币+0,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-1 22:10
weeqiang(金币+1,VIP+0):我用的就是 Random还是多换换条件吧，我准备选择不同植物的这个基因，进行比对，找到保守性较强的一段设计一对引物不知道行不行 6-2 13:36
不知道你用什么引物做的RT，建议用Random做一下，可能长度大一点的会有一些二级结构。有的基因用OligodT效果比较好，有的用Random效果好。如果还扩不出来建议换个位点重新设计引物。我们遇到过和你相似的情况，重设计引物后就扩出来了。

[ Last edited by Milanmy on 2009-6-1 at 22:04 ]
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9楼2009-06-01 21:58:37
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Milanmy

银虫 (小有名气)
未知序列时一般是这么做，已知序列的话多设计几个引物就行了，序列差异一般不会太大。现有引物可以降温做PCR，也有可能扩增出来，有一个错配就得降低6度来P，我有时会用43度来扩基因的，扩出多个片段测序看一下就行了。
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10楼2009-06-02 18:21:52
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