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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 胶回收后测序提示有高级结构
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面包树129

新虫 (小有名气)

[交流] 胶回收后测序提示有高级结构

对PCR凝胶电泳使用天根生物试剂盒进行胶回收，回收后送去测序，结果显示双链有高级结构，一共测序4个样，3个样双链有高级结构，一个单链有高级结构。之前不做胶回收直接将pcr样品测序，从来没有出现过这个情况。请问是不是胶回收过程导致这个结果，哪个步骤容易出现dna结构变化

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1楼 2019-07-22 11:58:29
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hooah

铁虫 (小有名气)
★
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你还真相信这些测序公司的说明？就是做不出来，给一个理由而已

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2楼2019-07-22 12:51:27
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longyueling

新虫 (小有名气)
★
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如果你用PCR样品送到公司测序，公司会跑胶分离回收，由于生物公司做胶回收技术成熟且用的试剂也不差，所以结果会比较理想。您自己回收存在高级结构的问题可能是由于您技术不娴熟，中间存在引入高级结构的步骤以及DNA被污染的风险，而且国产的试剂难免效果没有进口的好。建议您这边做完胶回收后用1uL的样品跑个鉴定胶，确定你回收的样品大小和浓度合适你在寄到公司去。
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3楼2019-08-07 16:30:40
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面包树129

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by longyueling at 2019-08-07 16:30:40
如果你用PCR样品送到公司测序，公司会跑胶分离回收，由于生物公司做胶回收技术成熟且用的试剂也不差，所以结果会比较理想。您自己回收存在高级结构的问题可能是由于您技术不娴熟，中间存在引入高级结构的步骤以及DN ...

最近又进行了两次实验，胶回收之后跑电泳条带很亮位置也正常，送样测序后显示27 F的单链全是高级结构，怀疑是不是引物的问题，如果引物稀释没有使用新打的去离子水，会有这么大的影响吗？另外引物干粉有可能超过1年了，但是反向引物也是同时合成的呀，为什么反向的测序结果正常呢，焦头烂额中，还望您不吝赐教，谢谢。另外我们PCR的体系是50微升的，从电泳条带亮度看这个量回收得到的产物浓度没有问题

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4楼2019-08-19 11:37:09
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王小笑er

新虫 (初入文坛)
★
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我用takara的胶回收从来没有出现过类似问题

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5楼2019-08-19 13:06:34
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longyueling

新虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 面包树129 at 2019-08-19 11:37:09
最近又进行了两次实验，胶回收之后跑电泳条带很亮位置也正常，送样测序后显示27 F的单链全是高级结构，怀疑是不是引物的问题，如果引物稀释没有使用新打的去离子水，会有这么大的影响吗？另外引物干粉有可能超过1年 ...

之前测序正常的时候用的引物也是你们自己合成的？那就不是引物设计的问题，你既然怀疑了就再稀释一次测序看看结果验证一下。有的时候公司测序出现该问题确实会重新稀释引物

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6楼2019-08-19 22:27:43
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面包树129

新虫 (小有名气)
后来又用新合成、新稀释的引物做了一次，高级结构非但没有消失反而更多了，原来是光27F有，现在1492R也有了，欲哭无泪呀
后续计划分别用同品牌新批号试剂盒和不同品牌试剂盒再考察一下。期间也咨询了其他专业人员，有的是胶回收之后，将产物再纯化一遍，个人理解这一步应该不会消除高级结构吧？还请各位指点一二
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7楼2019-10-10 09:34:18
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