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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 实验室分析、仪器 » 高效液相色谱柱堵了
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独家记忆fm

新虫 (小有名气)
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高效液相色谱柱堵了
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C18，4um的安捷伦高效液相色谱柱堵了，用5%的甲醇水0.1低流速冲洗，泵压不仅没有降低，反而越来越高是怎么回事

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1楼 2019-05-23 18:23:34
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独家记忆fm

新虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-23 20:49:01
盐浓度高不？用5%甲醇溶液冲，低速。
...

样品内盐浓度较高，但是进样量很低，只有5ul，之前我师兄也用这个样品走过样，没有任何问题。但是，我排除了其它可能性，只能想到可能是样品含盐而使柱子堵了

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15楼2019-05-23 20:51:11
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繁夏

版主 (知名作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
检查确定是泵堵了？

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7楼2019-05-23 19:28:49
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哀伤的骄傲

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看是什么赌的，极性还是非极性的或者是不溶的

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8楼2019-05-23 19:44:49
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小松鼠45

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亲，这边建议用纯水冲呢，因为纯水柱压更高！

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9楼2019-05-23 19:50:12
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)
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柱子堵了，要先确定是什么材料堵了，一般来说，是固体不溶物，小颗粒，还有就是盐粒子析出了。如果是样品没处理好，有固体不溶物，可以试试反冲，但是效果可能不是很好。如果只是盐离子析出了，可以用水份比较高的流动相来冲洗。如果不确定，可以用异丙醇冲洗，有些有机物也可以被异丙醇冲洗出来。也可以加热流动相，更好冲出堵住的盐离子。回到最初，用水冲就是柱压高，用乙腈冲柱压低。水的比例越高，柱压越高。刚开始用低流速冲，柱压明显下降了再增高流速。可能得冲一整天才能冲开。有点耐心。

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10楼2019-05-23 19:55:47
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独家记忆fm

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-23 19:28:49
检查确定是泵堵了？

是的，用两通测试和其它柱子测试了，确定是柱子堵了

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11楼2019-05-23 20:14:25
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独家记忆fm

新虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2019-05-23 19:55:47
柱子堵了，要先确定是什么材料堵了，一般来说，是固体不溶物，小颗粒，还有就是盐粒子析出了。如果是样品没处理好，有固体不溶物，可以试试反冲，但是效果可能不是很好。如果只是盐离子析出了，可以用水份比较高的流 ...

您好！谢谢您的帮助。问题是这样的，我的样品是含高浓度的磷酸氢二铵，流动相是甲醇和水，之前我师兄这样走过样，完全没有任何问题，但是最近我按师兄的方法就把柱子堵了，然后我咨询安捷伦的工程师，他们告诉用5%的甲醇水0.1低流速冲洗，在上上周我按这个方法花了一天半把柱子冲开了，考虑到柱子堵了的原因可能是因为我样品过了0.22的滤膜之后放太久而产生沉淀使柱子堵住了。因此，在前天我再次进样的时候，是上午处理完样品，下午拿去的，仪器才运行了不到两个小时，柱子又被堵了。昨天我就用5%的甲醇水冲了一整天，泵压不仅没有下降，反而升高很多。今天又试了反冲一天，泵压还是没有降下来。咨询安捷伦的工程师，建议我用纯的异丙醇来冲洗，本人是仪器小白一枚，查过之后发现异丙醇粘度大，不适宜冲柱子。现在很矛盾，不知道柱子是不是已经废了，求解答

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12楼2019-05-23 20:26:05
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8楼: Originally posted by 哀伤的骄傲 at 2019-05-23 19:44:49
看是什么赌的，极性还是非极性的或者是不溶的

请问您说的是流动相？流动相是甲醇和水，样品是含磷酸氢二铵的发酵液，但是进样量很低，5ul

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13楼2019-05-23 20:29:36
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繁夏

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11楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-23 20:14:25
是的，用两通测试和其它柱子测试了，确定是柱子堵了
...

盐浓度高不？用5%甲醇溶液冲，低速。

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14楼2019-05-23 20:49:01
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繁夏

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15楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-23 20:51:11
样品内盐浓度较高，但是进样量很低，只有5ul，之前我师兄也用这个样品走过样，没有任何问题。但是，我排除了其它可能性，只能想到可能是样品含盐而使柱子堵了
...

盐浓度高，如果不注意清洗柱子，用高有机相很容易结晶析出

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16楼2019-05-23 21:07:35
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16楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-23 21:07:35
盐浓度高，如果不注意清洗柱子，用高有机相很容易结晶析出
...

但是目前用95%水相依然冲不开柱子，考虑到所用流动相是否被污染，中途又重新配了一次，依然冲不开

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17楼2019-05-23 21:12:56
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繁夏

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17楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-23 21:12:56
但是目前用95%水相依然冲不开柱子，考虑到所用流动相是否被污染，中途又重新配了一次，依然冲不开
...

这个冲很慢，另外也可以考虑反冲

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18楼2019-05-23 22:10:11
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18楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-23 22:10:11
这个冲很慢，另外也可以考虑反冲
...

今天反冲了一整天泵压依然很高

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19楼2019-05-23 22:11:05
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小松鼠45

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异丙醇挺好用的，可以同时溶解盐离子和部分有机颗粒，所以是可以用异丙醇冲洗的。柱子堵了应该是你样品的问题，过滤处理后的样品要马上处理，比如发酵液，即便离心过滤处理，常温也就六个小时就可能有微生物长起来。不稳定的样品，比如容易絮凝的，容易氧化变色的，都可能在过滤处理后重新产生颗粒物，堵住柱子。建议以后要尽快跑样品，如果没办法马上跑，也应该在四度冰箱放置，上样品再检查一下是否有沉淀。盐离子沉淀后用水溶液比较高的溶液可以冲开，有机大分子，可以用异丙醇冲开。但是一些胶体大颗粒，还有菌体，是不怎么容易冲开的，只能尝试一下。建议尝试色谱纯异丙醇冲一下，不行就只能换一根柱子了。刚开始做实验确实容易掉坑里，帮实验室大师兄大师姐做半年免费劳动力，就是那种随叫随到，不管和自己实验有关无关都要认真做好的，就可以有效避免这些坑。

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20楼2019-05-24 00:22:27
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20楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2019-05-24 00:22:27
异丙醇挺好用的，可以同时溶解盐离子和部分有机颗粒，所以是可以用异丙醇冲洗的。柱子堵了应该是你样品的问题，过滤处理后的样品要马上处理，比如发酵液，即便离心过滤处理，常温也就六个小时就可能有微生物长起来。 ...

您好，谢谢您的解答！柱子被堵的原因除了可能是样品的原因，还考虑到流动相是不是被污染了，超纯水是从超纯水机上接来之后又过了0.22um的滤膜，色谱纯的甲醇也过了0.22um的滤膜，。实验室有位师姐说超纯水和色谱纯的甲醇均不用过滤膜，可以直接拿来用，过滤膜反而可能会受到污染。之前我也是这么做的，没有过滤膜，但是从第一次把柱子堵了之后，我做什么都很小心，这次是先把瓶子和过滤装置都清洗干净，烘干，然后润洗之后再拿来滤流动相。请问楼主在做实验的过程中超纯水和色谱纯的有机相在用之前需要再过一遍滤膜吗？样品是上午11点多过滤之后就放到4℃的冰箱里，大概下午3点的时候拿去进的样，产杂菌的可能性应该不大。排除各种原因，用5%甲醇水也不能把柱子冲开，只能想到流动相是不是出问题了。

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21楼2019-05-24 09:07:07
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繁夏

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21楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 09:07:07
您好，谢谢您的解答！柱子被堵的原因除了可能是样品的原因，还考虑到流动相是不是被污染了，超纯水是从超纯水机上接来之后又过了0.22um的滤膜，色谱纯的甲醇也过了0.22um的滤膜，。实验室有位师姐说超纯水和色谱纯 ...

你过的有机还是水系滤膜

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22楼2019-05-24 09:47:16
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22楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 09:47:16
你过的有机还是水系滤膜
...

水系滤膜

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23楼2019-05-24 10:44:51
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23楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 10:44:51
水系滤膜
...

样品含有机嘛？

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24楼2019-05-24 11:19:47
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24楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 11:19:47
样品含有机嘛？
...

样品是发酵液，里面除了常用的酵母膏，蛋白胨和葡萄糖，还有磷酸氢二铵

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25楼2019-05-24 11:27:37
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25楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 11:27:37
样品是发酵液，里面除了常用的酵母膏，蛋白胨和葡萄糖，还有磷酸氢二铵
...

你有机溶剂过水系滤膜，肯定有东西出来，你可以统一都用有机系

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26楼2019-05-24 11:31:03
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26楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 11:31:03
你有机溶剂过水系滤膜，肯定有东西出来，你可以统一都用有机系
...

样品是过的水系膜，有机流动相是过有机滤膜

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27楼2019-05-24 11:50:07
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27楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 11:50:07
样品是过的水系膜，有机流动相是过有机滤膜
...

还是不行？

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28楼2019-05-24 16:53:50
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28楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 16:53:50
还是不行？
...

目前没有冲开，打算换纯异丙醇冲，您是否用纯的异丙醇冲过柱子，查过一些资料说对柱子损害较大。

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29楼2019-05-24 18:19:32
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29楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 18:19:32
目前没有冲开，打算换纯异丙醇冲，您是否用纯的异丙醇冲过柱子，查过一些资料说对柱子损害较大。
...

我们做没这样堵过，我一般仪器使用后清洗比较勤

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30楼2019-05-24 18:28:14
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30楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 18:28:14
我们做没这样堵过，我一般仪器使用后清洗比较勤
...

请问您在做实验过程中，从超纯水机上接的超纯水和已经是色谱纯的有机相会再过一遍滤膜吗

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31楼2019-05-24 19:33:12
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繁夏

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31楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 19:33:12
请问您在做实验过程中，从超纯水机上接的超纯水和已经是色谱纯的有机相会再过一遍滤膜吗
...

不会，都是直接用，如果你样品盐浓度太高就稀释进样

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32楼2019-05-24 20:31:02
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32楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 20:31:02
不会，都是直接用，如果你样品盐浓度太高就稀释进样
...

好的。谢谢您的善心解答！还有个问题想向您咨询一下，我这根柱子是安捷伦4.6×150mm，咨询安捷伦的工程师说目前最好只能用进口的流动相来冲洗，国产的质量不好可能只会使柱子越来越堵。请问您平时在做实验过程中用的国产流动相吗？

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33楼2019-05-24 20:56:32
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33楼: Originally posted by 独家记忆fm at 2019-05-24 20:56:32
好的。谢谢您的善心解答！还有个问题想向您咨询一下，我这根柱子是安捷伦4.6×150mm，咨询安捷伦的工程师说目前最好只能用进口的流动相来冲洗，国产的质量不好可能只会使柱子越来越堵。请问您平时在做实验过程中用 ...

一般是用赛默飞的色谱纯

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34楼2019-05-24 21:21:03
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34楼: Originally posted by 繁夏 at 2019-05-24 21:21:03
一般是用赛默飞的色谱纯
...

好的，谢谢您！

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35楼2019-05-24 23:28:15
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hdchina20102楼
2019-05-23 18:24   回复  
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2846377833楼
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199411cjy4楼
2019-05-23 18:24   回复  
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zfpd27665楼
2019-05-23 18:25   回复  
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tzynew6楼
2019-05-23 18:26   回复  
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