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田鼠117

银虫 (小有名气)

[交流] 紧急内参问题求解

最近实验中,根据文献采用了human β-actin gene的引物, 上游为: 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’, 下游为: 5’-CTCCTTAATG TCACGCACGATTTC-3’ .我自己查了PUBMED后,得出PCR结果应为1091bp,RT-PCR为538bp.但是在具体实验中却发现PCR与RT结果均为538bp.但同条件下所做的human β-globin gene显示存在差异,表明应该是PCR与RT-PCR结果.麻烦各位高手给分析下问题所在,非常感谢.我的结果如图,第一个是PCR,第二个为RT-PCR

[ Last edited by 350784478 on 2009-8-17 at 17:26 ]
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

是不是污染了?你的模板cdna里边混有dna或者rt的不够彻底?建议设计引物在UTR端和polyA端,这样可以避免这种情况
会当凌绝顶,一览众山小
4楼2009-05-20 14:38:24
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amilie030312

金虫 (正式写手)

没看懂啥意思,是说你用RNA做模板做rt-pcr,再用DNA做模板做PCR,用的是同一对引物,但是两外显子中间有内含子所以rt-pcr和PCR的结果片段上有长度差异,但是现在两结果长度扩出来的一样,是这个意思吗?
2楼2009-05-20 10:20:05
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田鼠117

银虫 (小有名气)

是的,是这个意思,你能帮我看看是怎么回事吗?谢谢
3楼2009-05-20 10:34:08
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田鼠117

银虫 (小有名气)

我也怀疑过是污染,但是我的RT结果是正确的,反而是PCR结果不正确。
5楼2009-05-20 20:58:37
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