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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 紧急内参问题求解
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田鼠117

银虫 (小有名气)

[交流] 紧急内参问题求解

最近实验中,根据文献采用了human β-actin gene的引物, 上游为: 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’, 下游为: 5’-CTCCTTAATG TCACGCACGATTTC-3’ .我自己查了PUBMED后,得出PCR结果应为1091bp,RT-PCR为538bp.但是在具体实验中却发现PCR与RT结果均为538bp.但同条件下所做的human β-globin gene显示存在差异,表明应该是PCR与RT-PCR结果.麻烦各位高手给分析下问题所在,非常感谢.我的结果如图,第一个是PCR，第二个为RT-PCR

[ Last edited by 350784478 on 2009-8-17 at 17:26 ]
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1楼 2009-05-20 08:42:15
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amilie030312

金虫 (正式写手)
没看懂啥意思，是说你用RNA做模板做rt-pcr，再用DNA做模板做PCR，用的是同一对引物，但是两外显子中间有内含子所以rt-pcr和PCR的结果片段上有长度差异，但是现在两结果长度扩出来的一样，是这个意思吗？
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2楼2009-05-20 10:20:05
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田鼠117

银虫 (小有名气)
是的，是这个意思，你能帮我看看是怎么回事吗？谢谢
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3楼2009-05-20 10:34:08
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
是不是污染了？你的模板cdna里边混有dna或者rt的不够彻底？建议设计引物在UTR端和polyA端，这样可以避免这种情况
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会当凌绝顶，一览众山小
4楼2009-05-20 14:38:24
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田鼠117

银虫 (小有名气)
我也怀疑过是污染，但是我的RT结果是正确的，反而是PCR结果不正确。
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5楼2009-05-20 20:58:37
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田鼠117

银虫 (小有名气)
没有人可以解释吗？万分着急了！
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6楼2009-05-21 08:11:10
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amilie030312

金虫 (正式写手)
呵呵，内含子不见啦
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7楼2009-05-21 10:01:53
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田鼠117

银虫 (小有名气)
为什么会出现这种情况呢？会吗？
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8楼2009-05-21 10:09:54
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yoyocan

金虫 (正式写手)
你的目的 基因 这么小  本身没有内含子也是很正常的啊
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9楼2009-05-21 10:29:16
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amilie030312

金虫 (正式写手)
LZ还是先到NCBI上去确认一下你要做的那个物种的序列是否不要做的那部分是含有内含子的吧，片段内如果没有内含子只有外显子的话那从RNA做RT-PCR和从DNA做PCR得到的片段长度一样是完全正常的结果，如果你直接从RNA做PCR还能扩增出片段那只能说明你抽提的RNA里面有DNA的污染了。
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10楼2009-05-21 10:48:57
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