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Misterboy

铁虫 (正式写手)

[求助] overlap PCR 已有2人参与

有一个大约10kb的片段,分成两段,用PCR扩增出来了,且两片段之间有25BP的同源臂,现在用overlap PCR一直扩不出目的片段,出现了非特异型扩增,primer用的还是原来的,一个片段的上游引物,一个片段的下游引物,延伸时间增加了一倍,但一直做不出来,各位有为有好一点的建议?
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 眺望爱 at 2019-05-30 16:57:28
10kb很大了,这个延伸应该要很久吧,你可以把overlap搞长一点啊,比如如果总共两百条编号引物,1-100扩一个,97或者99-200扩一个,这样overlap不就够长了嘛,overlap很重要的,重组还是扩增,短了就没法成功。
...

感谢,说的很在理,回头我试试

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8楼2019-05-30 23:42:40
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qingai0128

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-10 17:53:39
没有细节,怎么判断? 引起非特异性扩增的原因有很多,Mg2+浓度过高、退火温度太低、引物特异性不好等等原因
至少要把细节贴出来。
从此以后309了
2楼2019-05-09 10:19:55
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KM石头

金虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-10 17:53:52
建议先不加引物,其他正常加,进行10个循环,待温度下降,再加上引物进行30个循环

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2019-05-09 22:38:57
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KM石头

金虫 (正式写手)

你可以尝试一下,我都是这样做的,都是成功的

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4楼2019-05-09 22:40:27
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