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Misterboy

铁虫 (正式写手)

[求助] overlap PCR 已有2人参与

有一个大约10kb的片段,分成两段,用PCR扩增出来了,且两片段之间有25BP的同源臂,现在用overlap PCR一直扩不出目的片段,出现了非特异型扩增,primer用的还是原来的,一个片段的上游引物,一个片段的下游引物,延伸时间增加了一倍,但一直做不出来,各位有为有好一点的建议?
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by KM石头 at 2019-05-09 22:38:57
建议先不加引物,其他正常加,进行10个循环,待温度下降,再加上引物进行30个循环

嗯嗯,感谢,融合大片段,是不是延伸时间也相应的增加了

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6楼2019-05-10 08:26:40
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qingai0128

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-10 17:53:39
没有细节,怎么判断? 引起非特异性扩增的原因有很多,Mg2+浓度过高、退火温度太低、引物特异性不好等等原因
至少要把细节贴出来。
从此以后309了
2楼2019-05-09 10:19:55
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KM石头

金虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-10 17:53:52
建议先不加引物,其他正常加,进行10个循环,待温度下降,再加上引物进行30个循环

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2019-05-09 22:38:57
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KM石头

金虫 (正式写手)

你可以尝试一下,我都是这样做的,都是成功的

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4楼2019-05-09 22:40:27
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