应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆小白有问题请教～～～ 平板无菌落TT
61/1返回列表
查看: 1220  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

skynet999

新虫 (初入文坛)

[交流] 克隆小白有问题请教～～～ 平板无菌落TT

求助盆友们～ 最近做了一个月的cloning无果… 很悲伤 详情如下：

载体10787bp EcoRI 和BglII双酶切 酶切位点很近 都是NEB的酶 取5ugDNA  50ul体系 酶切后成功胶回收 浓度大概160ng/ul

PCR产物200bp 为了提高片段浓度 合并了几次pcr产物 然后胶回收 过夜双酶切 也用的50ul体系 酶切后用PCR产物纯化Kit 得到PCR产物浓度大概200ng/ul

连接用了20ul体系 T4连接酶1ul 载体4ul PCR产物6ul 室温连接两小时后转化 第二天平板特别干净 无克隆菌落… 这是第三次做这个实验了 之前两次也是没有克隆 不过加的载体和PCR产物量比较少 所以这次加大量 还是无果… 表示不知道什么原因 每次跑胶看条带也都很正常 实在找不到症结所在 TT 求助大家伙儿………

发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-05-05 17:34:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sannny

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用Gibson无缝克隆吧，包你一次成功。相当简单啊。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2019-05-05 17:55:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木元雨

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没连接上？还是抗性弄错了？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2019-05-05 18:02:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

skynet999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 木元雨 at 2019-05-05 18:02:18
没连接上？还是抗性弄错了？

抗性肯定没错 连没连上倒是没有验证…… 感觉不应该是没连上呀

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
4楼2019-05-06 03:38:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
胶回收后用仪器测定的浓度吗？有没有跑胶看看，我建议多回收几管跑胶预测浓度
赞一下 回复此楼
5楼2019-05-06 09:00:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

木元雨

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by skynet999 at 2019-05-06 03:38:31
抗性肯定没错 连没连上倒是没有验证…… 感觉不应该是没连上呀
...

有没有连上，做对照实验就知道了。把阳性对照和阴性对照都做下

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2019-05-06 11:46:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 skynet999 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料325求调剂 30+6 mariusuki 2026-03-02 11/550 2026-03-07 17:39 by fantasticxu
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4 +3 7mzg0e04z2 2026-03-06 5/250 2026-03-07 17:20 by i6un4pi8fv
[硕博家园] 售SCI文章，我:8.O.5.5.1.O.5.4 +3 7mzg0e04z2 2026-03-06 3/150 2026-03-07 17:05 by i6un4pi8fv
[考研] 考研一志愿长安大学材料与化工309分请求调剂 +3 dtdxzxx 2026-03-06 5/250 2026-03-06 18:01 by houyaoxu
[考研] 266材料化工求调剂 +5 哇塞王帅 2026-03-03 5/250 2026-03-06 16:44 by 学员FnSWZj
[考研] 初试297求调剂 +3 一个萝萝 2026-02-28 3/150 2026-03-06 16:37 by @飒飒飒飒
[考研] 289求调剂 +3 驰光绝景 2026-03-04 4/200 2026-03-06 12:34 by 驰光绝景
[考研] 080500材料科学与工程 +13 202114020319 2026-03-03 13/650 2026-03-06 00:29 by wutongshun
[考研] 【求调剂】293分环境工程求调剂材料/化工，服从调剂，抗压能力强！ +8 xiiiia 2026-03-04 8/400 2026-03-05 20:01 by wangjihu
[考研] 复试调剂 +5 呼呼？~+123456 2026-03-05 5/250 2026-03-05 19:43 by caszguilin
[考研] 0856材料与化工，270求调剂 +17 YXCT 2026-03-01 20/1000 2026-03-05 09:22 by 一切OK
[考研] 264求调剂 +8 26调剂 2026-03-03 8/400 2026-03-04 20:50 by 一切OK
[考研] 本科太原理工采矿工程，求调剂 +3 onlx 2026-03-01 3/150 2026-03-04 15:57 by Stephen_ym
[考研] 085600 英一数二272求调剂 5+6 vida_a 2026-03-01 47/2350 2026-03-04 13:35 by vida_a
[考研] 298求调剂一志愿中海洋 +3 lour. 2026-03-03 3/150 2026-03-03 20:41 by gxg2025
[考研] 江苏省农科院招调剂1名 +5 Qwertyuop 2026-03-01 5/250 2026-03-03 17:50 by 梅子鸭鸭
[考研] 一志愿中石油（华东）本科齐鲁工业大学 +3 石能伟 2026-03-02 3/150 2026-03-02 18:54 by caszguilin
[考研] 调剂 +3 13853210211 2026-03-02 4/200 2026-03-02 10:16 by 13853210211
[考研] 279求调剂 +3 dua1 2026-03-01 4/200 2026-03-02 00:23 by 大脸蛋子
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭