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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆小白有问题请教～～～ 平板无菌落TT
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skynet999

新虫 (初入文坛)

[交流] 克隆小白有问题请教～～～ 平板无菌落TT

求助盆友们～ 最近做了一个月的cloning无果… 很悲伤 详情如下：

载体10787bp EcoRI 和BglII双酶切 酶切位点很近 都是NEB的酶 取5ugDNA  50ul体系 酶切后成功胶回收 浓度大概160ng/ul

PCR产物200bp 为了提高片段浓度 合并了几次pcr产物 然后胶回收 过夜双酶切 也用的50ul体系 酶切后用PCR产物纯化Kit 得到PCR产物浓度大概200ng/ul

连接用了20ul体系 T4连接酶1ul 载体4ul PCR产物6ul 室温连接两小时后转化 第二天平板特别干净 无克隆菌落… 这是第三次做这个实验了 之前两次也是没有克隆 不过加的载体和PCR产物量比较少 所以这次加大量 还是无果… 表示不知道什么原因 每次跑胶看条带也都很正常 实在找不到症结所在 TT 求助大家伙儿………

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1楼 2019-05-05 17:34:10
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sannny

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用Gibson无缝克隆吧，包你一次成功。相当简单啊。

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2楼2019-05-05 17:55:06
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木元雨

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没连接上？还是抗性弄错了？

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3楼2019-05-05 18:02:18
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skynet999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 木元雨 at 2019-05-05 18:02:18
没连接上？还是抗性弄错了？

抗性肯定没错 连没连上倒是没有验证…… 感觉不应该是没连上呀

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4楼2019-05-06 03:38:31
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
胶回收后用仪器测定的浓度吗？有没有跑胶看看，我建议多回收几管跑胶预测浓度
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5楼2019-05-06 09:00:39
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木元雨

木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by skynet999 at 2019-05-06 03:38:31
抗性肯定没错 连没连上倒是没有验证…… 感觉不应该是没连上呀
...

有没有连上，做对照实验就知道了。把阳性对照和阴性对照都做下

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6楼2019-05-06 11:46:57
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