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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助启动子构建载体问题
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di_chen

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助启动子构建载体问题 已有1人参与

求助大家！！！我目前在克隆启动子，好不容易P出了2600bp左右的条带，回收之后构建到PBI121和PAbAi载体上，重复做了不少于20次，都能长出菌斑，但是鉴定都没有阳性克隆。我检查了回收的片段产物，酶切产物都没有问题，也试过了不同的比例（片段产物/酶切产物），但还是没有用。但这是我的毕业课题，也不能一直拖着吧，然后找生物公司帮忙做，他们看了我的序列说是靠近CDS区域的序列AT含量太高，GC含量低，并且是构建到低拷贝载体上，不容易做，但他们做了半个月了，也没啥动静，简直是急死我了。。。。。现在不知道要咋办了，所以请大家帮我看一下，有什么办法解决没有。不胜感激！！！
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1楼 2019-03-19 20:47:57
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小松鼠45

捐助贵宾 (正式写手)
换另一个启动子。全合成启动子序列。重新设计引物定位到GC含量正常的区间

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2楼2019-03-20 00:41:07
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chenpp2006

新虫 (正式写手)
试试同源重组

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

di_chen
3楼2019-03-20 05:16:17
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
可以考虑丢给我做（站短我哦）。。嘿嘿。。
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4楼2019-03-20 11:21:04
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di_chen

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by chenpp2006 at 2019-03-20 05:16:17
试试同源重组

谢谢，这个方法我试过了，但是鉴定的时候没有阳性克隆
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5楼2019-03-20 13:54:48
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di_chen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2019-03-20 00:41:07
换另一个启动子。全合成启动子序列。重新设计引物定位到GC含量正常的区间

您好，您说的换是怎么换？我确实了要做那个基因，而且那段GC含量异常的序列刚好在CDS序列前面，并且有800bp左右，不能不要这一段吧。
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6楼2019-03-20 14:03:32
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buchongyang

铜虫 (小有名气)
楼主的目的片段和连接有没有问题？引物设计呢？

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7楼2019-03-20 23:06:10
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di_chen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by buchongyang at 2019-03-20 23:06:10
楼主的目的片段和连接有没有问题？引物设计呢？

我用的是同源重组的方法，直接用加有酶切位点的引物扩增目的片段，扩增的片段单一，大小差不多，应该没啥问题。只是有可能真的没有连接上。。。长出来的都是空载，但是我换了好几个比例，还是没有用
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8楼2019-03-21 09:34:37
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好运连连OK

新虫 (小有名气)
实在连接不上也可以考虑用全基因合成的方式，把你的目的片段直接在载体上合成

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9楼2019-03-21 12:24:20
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di_chen

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 好运连连OK at 2019-03-21 12:24:20
实在连接不上也可以考虑用全基因合成的方式，把你的目的片段直接在载体上合成

谢谢，还能直接把片段合成在载体上啊，载体有10000多bp呢，我只知道合成基因
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10楼2019-03-21 13:44:50
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