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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何检测蛋白在大肠杆菌中的不表达是因为mRNA的不稳定？
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hongkaichen

金虫 (小有名气)

[交流] 如何检测蛋白在大肠杆菌中的不表达是因为mRNA的不稳定？

RT   如何检测蛋白在大肠杆菌中的不表达是因为mRNA的不稳定？
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1楼 2009-05-09 19:57:52
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lifefamily

★
hongkaichen(金币+1,VIP+0):谢谢回答，这是老师的一个作业，跟实验无关. 5-13 12:55
有怎么一说？
不表达的因素多了：
细胞毒性，N端信号肽，稀有密码子，等等。
你换GST或者Trx融合试过了么？
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2楼2009-05-13 10:23:30
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hongkaichen

金虫 (小有名气)
这是老师的一个作业，思考题，跟实验无关，因为mRNA不稳定也可能造成蛋白不表达，所以如果是这种原因，就是让我们用什么方法验证是不是这种原因。开始我觉得可以用观察多聚核糖体现象来验证，但这种方法不能排除菌自身的蛋白表达也能产生这种现象。如果用RT-PCR  P出来了不知道能不能说有mRNA存在，然后排除掉这种原因？
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3楼2009-05-13 13:01:09
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lifefamily

真的，我还第一次听说跟mRNA不稳定有关，孤陋寡闻了……
三、mRNA稳定性与翻译控制
mRNA稳定性主要取决于3’—UTR结构
1．poly(A)尾增加mRNA稳定性，
2．3’-UTR中UA序列导致mRNA不稳定．


高手帮我扫盲一下！？

[ Last edited by lifefamily on 2009-5-13 at 15:09 ]
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4楼2009-05-13 15:06:50
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hongkaichen

金虫 (小有名气)
在大肠杆菌中表达可能就没有polyA修饰，mRNA不稳定我觉得可能就是半衰期短，不能及时翻译。
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5楼2009-05-13 15:21:12
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lifefamily

关键是，大肠杆菌是如此成熟的一个表达系统，为何就你这个蛋白的mRNA没有polyA修饰呢？
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6楼2009-05-13 15:38:55
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hongkaichen

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lifefamily at 2009-5-13 15:38:
关键是，大肠杆菌是如此成熟的一个表达系统，为何就你这个蛋白的mRNA没有polyA修饰呢？

这个我不知道怎么回答你，在大肠杆菌里确实有一小段polyA，如果PolyA酶突变了，或其他与ployA形成有关的蛋白突变了导致PolyA不能形成，这样导致mRNA不稳定也可能。其实我想问的重点是假如是mRNA不稳定的话，有什么方法可以检测？如果你要说不可能是mRNA不稳定照成的，那么你就设计一个实验来排除这种可能，理论还是需要实验来验证的。
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7楼2009-05-13 16:10:56
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lifefamily

★ ★ ★ ★
hongkaichen(金币+4,VIP+0):谢谢讨论，我也没想到别的什么好方法了。 5-14 13:11
RT-PCR加Northern blot
其他想不到了。
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8楼2009-05-14 08:50:45
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
在原核生物中转录和翻译是同时进行的，就算是mRNA在不稳定也有一定的表达。如果真的要检测mRNA的稳定性，可以看看在细胞中的含量。
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9楼2009-05-14 13:13:32
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rourou6199

银虫 (初入文坛)
好像可以加ActD或者Dox抑制转录后，分几个时间段提RNA做Northern看RNA降解没有
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10楼2009-05-14 17:18:20
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