应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教：荧光定量PCR相关问题
51/1返回列表
查看: 2138  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Cherishqj

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教：荧光定量PCR相关问题 已有1人参与

大家小年好！给各位虫友拜个早年呀，本人年后要做qPCR实验，老师要求在假期写好实验方案，查阅了RT-qPCR相关资料，仍有一些问题不太清楚，希望大家帮忙解答一下。
首先我做这个实验是为了确定该基因在两种不同条件下的表达量，所以选择相对定量的方法，实验步骤分为提取RNA、反转录制备cDNA、以cDNA为模板定量PCR三块，我的问题是：1 参照基因怎么选择，好像有GAPDH和actin（我知道的是这两种），但是这两个基因存在于我的实验菌株Sphingomonas sp吗？如果存在的话我是否需要逐个确定参照基因的表达量是稳定的，选出最合适的内参基因
2 反转录制备的cDNA是单链吗？是否需要以cDNA为模板合成互补链？为什么
3 反转录之后获得的应该是cDNA 池吧，因为RNA有三种啊，在不知道模板序列的情况下怎么设计目标基因的引物？
4 参照基因的引物怎么设计
5 在测定实验样本的目标基因和参照基因的Ct值时，起始RNA的量是否应该一致，做对照样本的实验时，RNA的量是否应该与实验组调整成相同
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-01-29 22:24:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小乌龟@

新虫 (正式写手)
设计荧光定量引物，楼主问个问题，最近也在做这方面，要知道某基因表达量，在NCBI里找到基因序列，是以mRNA设计引物的还是cDNA序列？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2019-04-27 00:05:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2019-01-30 08:47:40
1  参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。
2 cDNA是双链。
3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基因的模板序列，只能祈求能在文献里找，看有没有人在别的菌种里做过这个目标基因，找到这个其他菌种里基因的序列，在NCBI上比对，看能否找到在 phingomonas sp的这个基因序列，再设计引物了。
5 起始的RNA量最好都调成一致。包括对照样本和基因样本。
赞一下 回复此楼
。
2楼2019-01-29 23:10:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2019-01-29 23:10:50
1  参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。
2 cDNA是双链。
3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基 ...

非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道目的基因的DNA序列了，理论上来说cDNA的序列与已知目的基因序列是一样的对吗？
赞一下 回复此楼
3楼2019-01-30 10:46:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Cherishqj at 2019-01-30 10:46:30
非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道 ...

纠正一下：一般进行逆转录时合成的仅为单链的DNA，但是足够引发扩增反应，在一个循环以后正义反义两条链均存在于体系内。双链DNA在变性之后也成为单链DNA，扩增时的效率和动力学与单链DNA差别不大。

关于第三点，cDNA序列是没有内含子的，如果你做的是原核生物是没有内含子的，也就是DNA序列就是cDNA序列。真核生物是有内含子的，cDNA序列和DNA序列是不同的。
赞一下(1人) 回复此楼
。
4楼2019-01-30 14:49:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 289求调剂 +5 步川酷紫123 2026-03-11 5/250 2026-03-15 00:45 by kruisytel
[考研] 一志愿武理314求调剂 +5 （￣～￣;） 2026-03-08 6/300 2026-03-15 00:33 by wht0531
[考研] 化学调剂0703 +6 啊我我的 2026-03-11 6/300 2026-03-14 22:24 by shangxh
[考研] 本科南京大学一志愿川大药学327 +3 麦田耕者 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:04 by 外星文明
[教师之家] 焦虑 +5 水冰月月野兔 2026-03-13 7/350 2026-03-14 15:14 by 农药害害
[考研] 一志愿哈工大材料324分求调剂 +5 闫旭东 2026-03-14 5/250 2026-03-14 14:53 by 木瓜膏
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +5 SUICHILD 2026-03-12 5/250 2026-03-14 14:53 by jean5056
[考研] 290 材料与化工求调剂 +9 Nebulala 2026-03-08 9/450 2026-03-14 03:55 by JourneyLucky
[考研] 085600求调剂 +3 a邵星池 2026-03-09 3/150 2026-03-14 01:32 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +6 yfihxh 2026-03-09 6/300 2026-03-14 01:18 by JourneyLucky
[考研] 318求调剂 +3 李新光 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:21 by JourneyLucky
[考研] 337一志愿华南理工0805材料求调剂 +7 mysdl 2026-03-11 9/450 2026-03-13 22:43 by JourneyLucky
[考研] 泣血叩求调剂恩，愿以丹心报师恩 +6 Iuruoh 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:06 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] 求调剂 +3 程雨杭 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:06 by JourneyLucky
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。，。，。，。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 资源与环境 285 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:31 by houyaoxu
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考博] 求材料读博院校 +9 yanglei131 2026-03-08 9/450 2026-03-10 11:54 by 天道酬勤2026686
[考研] 数二英二309分请求调剂 +3 dtdxzxx 2026-03-09 4/200 2026-03-09 19:56 by yuningshan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭