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请教：荧光定量PCR相关问题 已有1人参与
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大家小年好！给各位虫友拜个早年呀，本人年后要做qPCR实验，老师要求在假期写好实验方案，查阅了RT-qPCR相关资料，仍有一些问题不太清楚，希望大家帮忙解答一下。 首先我做这个实验是为了确定该基因在两种不同条件下的表达量，所以选择相对定量的方法，实验步骤分为提取RNA、反转录制备cDNA、以cDNA为模板定量PCR三块，我的问题是：1 参照基因怎么选择，好像有GAPDH和actin（我知道的是这两种），但是这两个基因存在于我的实验菌株Sphingomonas sp吗？如果存在的话我是否需要逐个确定参照基因的表达量是稳定的，选出最合适的内参基因 2 反转录制备的cDNA是单链吗？是否需要以cDNA为模板合成互补链？为什么 3 反转录之后获得的应该是cDNA 池吧，因为RNA有三种啊，在不知道模板序列的情况下怎么设计目标基因的引物？ 4 参照基因的引物怎么设计 5 在测定实验样本的目标基因和参照基因的Ct值时，起始RNA的量是否应该一致，做对照样本的实验时，RNA的量是否应该与实验组调整成相同 |
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1 参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。 2 cDNA是双链。 3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基因的模板序列，只能祈求能在文献里找，看有没有人在别的菌种里做过这个目标基因，找到这个其他菌种里基因的序列，在NCBI上比对，看能否找到在 phingomonas sp的这个基因序列，再设计引物了。 5 起始的RNA量最好都调成一致。包括对照样本和基因样本。 |
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