应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教：荧光定量PCR相关问题
81/1返回列表
查看: 2132  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Cherishqj

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教：荧光定量PCR相关问题 已有1人参与

大家小年好！给各位虫友拜个早年呀，本人年后要做qPCR实验，老师要求在假期写好实验方案，查阅了RT-qPCR相关资料，仍有一些问题不太清楚，希望大家帮忙解答一下。
首先我做这个实验是为了确定该基因在两种不同条件下的表达量，所以选择相对定量的方法，实验步骤分为提取RNA、反转录制备cDNA、以cDNA为模板定量PCR三块，我的问题是：1 参照基因怎么选择，好像有GAPDH和actin（我知道的是这两种），但是这两个基因存在于我的实验菌株Sphingomonas sp吗？如果存在的话我是否需要逐个确定参照基因的表达量是稳定的，选出最合适的内参基因
2 反转录制备的cDNA是单链吗？是否需要以cDNA为模板合成互补链？为什么
3 反转录之后获得的应该是cDNA 池吧，因为RNA有三种啊，在不知道模板序列的情况下怎么设计目标基因的引物？
4 参照基因的引物怎么设计
5 在测定实验样本的目标基因和参照基因的Ct值时，起始RNA的量是否应该一致，做对照样本的实验时，RNA的量是否应该与实验组调整成相同
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-01-29 22:24:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2019-01-30 08:47:40
1  参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。
2 cDNA是双链。
3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基因的模板序列，只能祈求能在文献里找，看有没有人在别的菌种里做过这个目标基因，找到这个其他菌种里基因的序列，在NCBI上比对，看能否找到在 phingomonas sp的这个基因序列，再设计引物了。
5 起始的RNA量最好都调成一致。包括对照样本和基因样本。
赞一下 回复此楼
。
2楼2019-01-29 23:10:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2019-01-29 23:10:50
1  参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。
2 cDNA是双链。
3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基 ...

非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道目的基因的DNA序列了，理论上来说cDNA的序列与已知目的基因序列是一样的对吗？
赞一下 回复此楼
3楼2019-01-30 10:46:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Cherishqj at 2019-01-30 10:46:30
非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道 ...

纠正一下：一般进行逆转录时合成的仅为单链的DNA，但是足够引发扩增反应，在一个循环以后正义反义两条链均存在于体系内。双链DNA在变性之后也成为单链DNA，扩增时的效率和动力学与单链DNA差别不大。

关于第三点，cDNA序列是没有内含子的，如果你做的是原核生物是没有内含子的，也就是DNA序列就是cDNA序列。真核生物是有内含子的，cDNA序列和DNA序列是不同的。
赞一下(1人) 回复此楼
。
4楼2019-01-30 14:49:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

熊猫爱喝红酒

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Cherishqj at 2019-01-30 10:46:30
非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道 ...

RT-PCR是反转录出第一条cDNA链，之后以此链为模板继续以指数形式扩增，左后得到的是整个双链DNA

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2019-04-26 23:31:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小乌龟@

新虫 (正式写手)
设计荧光定量引物，楼主问个问题，最近也在做这方面，要知道某基因表达量，在NCBI里找到基因序列，是以mRNA设计引物的还是cDNA序列？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2019-04-27 00:05:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

junjieshao

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2019-04-27 04:28:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

基因cas

铁虫 (小有名气)
emuch: 屏蔽内容, 违规存档, 违规发布联系方式 2019-04-30 19:51:05
本帖内容被屏蔽
8楼2019-04-30 16:05:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Cherishqj 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0805，333求调剂 +3 112253525 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:42 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中科院，化学方向，295求调剂 +4 一氧二氮 2026-03-11 4/200 2026-03-13 22:35 by JourneyLucky
[考研] 308求调剂 +5 是Lupa啊 2026-03-11 5/250 2026-03-13 22:13 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] ［0860］321分求调剂，ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[考研] 307求调剂 +5 超级伊昂大王 2026-03-12 5/250 2026-03-13 15:56 by 棒棒球手
[考研] 化学学硕求调剂 +8 努力奋斗112 2026-03-12 9/450 2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +3 S.H1 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:15 by JourneyLucky
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +4 SUICHILD 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:14 by JourneyLucky
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 一志愿河海大学085900土木水利专硕279求调剂不挑专业 +4 SunWwWwWw 2026-03-10 8/400 2026-03-13 02:23 by SunWwWwWw
[考研] 0817化学工程319求调剂 +8 lv945 2026-03-08 10/500 2026-03-12 05:26 by wll0811
[考研] 265求调剂 +8 小木虫085600 2026-03-09 11/550 2026-03-10 19:44 by 绿色低碳化学
[考研] 328，0703考生求调剂，一志愿为东北师范大学 +3 观素律 2026-03-09 4/200 2026-03-10 15:58 by houyaoxu
[考研] 0817一志愿苏州大学280复试调剂 +9 kk扛 2026-03-07 9/450 2026-03-10 14:20 by peike
[硕博家园] 木虫好像不热闹了，是不是？ +4 偏振片 2026-03-10 4/200 2026-03-10 09:51 by longwave
[考研] 求调剂，一志愿江南大学，食品科学与工程，总分，320 +3 yyyyyukino 2026-03-07 3/150 2026-03-08 23:07 by 清风月
[考研] 求调剂 +3 拾柒12。 2026-03-08 3/150 2026-03-08 17:33 by bingxueer79
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭