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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教：荧光定量PCR相关问题
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教：荧光定量PCR相关问题 已有1人参与

大家小年好！给各位虫友拜个早年呀，本人年后要做qPCR实验，老师要求在假期写好实验方案，查阅了RT-qPCR相关资料，仍有一些问题不太清楚，希望大家帮忙解答一下。
首先我做这个实验是为了确定该基因在两种不同条件下的表达量，所以选择相对定量的方法，实验步骤分为提取RNA、反转录制备cDNA、以cDNA为模板定量PCR三块，我的问题是：1 参照基因怎么选择，好像有GAPDH和actin（我知道的是这两种），但是这两个基因存在于我的实验菌株Sphingomonas sp吗？如果存在的话我是否需要逐个确定参照基因的表达量是稳定的，选出最合适的内参基因
2 反转录制备的cDNA是单链吗？是否需要以cDNA为模板合成互补链？为什么
3 反转录之后获得的应该是cDNA 池吧，因为RNA有三种啊，在不知道模板序列的情况下怎么设计目标基因的引物？
4 参照基因的引物怎么设计
5 在测定实验样本的目标基因和参照基因的Ct值时，起始RNA的量是否应该一致，做对照样本的实验时，RNA的量是否应该与实验组调整成相同
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1楼 2019-01-29 22:24:05
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熊猫爱喝红酒

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Cherishqj at 2019-01-30 10:46:30
非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道 ...

RT-PCR是反转录出第一条cDNA链，之后以此链为模板继续以指数形式扩增，左后得到的是整个双链DNA

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5楼2019-04-26 23:31:57
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2019-01-30 08:47:40
1  参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。
2 cDNA是双链。
3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基因的模板序列，只能祈求能在文献里找，看有没有人在别的菌种里做过这个目标基因，找到这个其他菌种里基因的序列，在NCBI上比对，看能否找到在 phingomonas sp的这个基因序列，再设计引物了。
5 起始的RNA量最好都调成一致。包括对照样本和基因样本。
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。
2楼2019-01-29 23:10:50
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2019-01-29 23:10:50
1  参照基因怎么选择，可以参考文献，百度文献或者知网 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文献会给你内参基因的引物序列，直接合成即可。
2 cDNA是双链。
3. 反转录获得的是cDNA池。如果你不知道目标基 ...

非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道目的基因的DNA序列了，理论上来说cDNA的序列与已知目的基因序列是一样的对吗？
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3楼2019-01-30 10:46:30
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Cherishqj at 2019-01-30 10:46:30
非常感谢你的回复，我还有点不太明白
第2点 cDNA是双链，cDNA不是以RNA为模板合成的互补DNA链吗，为什么会是双链呢，我好像看到过反转录得到cDNA后又合成cDNA第二链的实验（忘记在哪里看的了）
第3点 我已经知道 ...

纠正一下：一般进行逆转录时合成的仅为单链的DNA，但是足够引发扩增反应，在一个循环以后正义反义两条链均存在于体系内。双链DNA在变性之后也成为单链DNA，扩增时的效率和动力学与单链DNA差别不大。

关于第三点，cDNA序列是没有内含子的，如果你做的是原核生物是没有内含子的，也就是DNA序列就是cDNA序列。真核生物是有内含子的，cDNA序列和DNA序列是不同的。
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。
4楼2019-01-30 14:49:14
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