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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR老是P不出来？？
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)

[交流] PCR老是P不出来？？

最近做PCR，老是P不出来，不知道什么原因。用以前提的DNA是可以P出来，但是最近新提的基因组DNA就总是失败，我认为引物和酶等包括反应体系都是没有问题的，因为我后来又把以前冻存在-20°的一点DNA重新P了一次，结果是可以成功。
  总之情况就是同样的体系，用以前的DNA做模版可以P出来，而用新提取的DNA做模版却P不出来？怎么会出现这样的结果，难道是我新提取的DNA里面有杂质、蛋白或者是RNA之类的东西，又或者是DNA的浓度太高了？请高手帮我分析分析呀，谢谢！！
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1楼 2009-05-06 16:01:04
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wangzhebasa

木虫 (著名写手)
做个模板浓度梯度看看
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...................我是美丽的签名档..................Ifeelsomethinghere.Somethingtrue.
2楼2009-05-06 16:15:03
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lywinan

捐助贵宾 (职业作家)
1.可以考虑做一个模板的浓度梯度
2.利用DNA纯化试剂盒做一下纯化
3.使用管家基因如β-actin做一个PCR
4.增加引物的浓度
5.增加mg2+浓度
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3楼2009-05-06 17:00:30
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j2

木虫 (正式写手)
要P 的那段是不是在质粒上啊，是的话就要考虑质粒丢失的问题
模板跑电泳看看吧，可以看看浓度问题
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
4楼2009-05-07 09:55:34
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
1、模板的浓度梯度我做过，分别是稀释10倍，20倍的
2、这个不纯的DNA对PCR是不是有影响呀？我看我的DNA里可能有一些RNA，有一点拖尾
3、以前用这样的引物浓度和反应体系P出来过，现在就是P不出来，是不是有可能是DNA出问题了？
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5楼2009-05-07 10:00:15
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zhangqshijf2003

金虫 (小有名气)
很简单，DNA质量不行
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6楼2009-05-07 14:07:38
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jqq1985

银虫 (正式写手)
说明这批质量不好，重提。
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7楼2009-05-07 19:24:50
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profee

建议重提，祝你成功！
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8楼2009-05-07 21:20:10
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yuan8285

捐助贵宾 (小有名气)

杏林小生
你DNA的序列检查过没，如果CG比例过高的话就会P不出来，需要改变退火温度以及使用的体系。
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加倍珍惜自己
9楼2009-05-08 12:32:00
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
DNA应该不存在GC含量高的问题吧，有这样的问题话，上次也就不能P出来呀，而我这次把上次提的DNA的一点点残留做模板又P了一次，还是可以P出来，所以我怀疑很大的可能性应该是这次提的DNA有问题，但是现在不知道到底是DNA的浓度的问题还是DNA有污染，或者是有突变！！
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10楼2009-05-09 17:38:11
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