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xiaoxueliu

木虫 (著名写手)

[交流] Taq酶提取问题,急切希望得到指点

那位提取过Taq酶的高手给指点一下:我提得Taq酶活性不高,还有一个特点就是刚开始用还可以,用过2,3次酶的活性越来越低,请问在酶的提取过程中有哪些细节需要注意,还有几个问题:
1,菌液培养的时间和量度?
2,提取过程中离心,水浴的注意事项
3,透析的时间和注意事项,如果透析时间过长,或中间透析时间过长才换新的透析液对美的质量会有什么影响?
急切想得到高手指点,谢谢,谢谢!!!
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jqq1985

银虫 (正式写手)

★ ★
xiaoxueliu(金币+2,VIP+0):谢谢,不过保存液中有50%的甘油啊 5-6 16:27
你说开始还行,后面不行了,应该是保存的问题把。往保存液中加到10%甘油和1mM DTT吧,那样保存效果好些。还有分管保藏,不要每次都从一个管子里面取。我原来也是做高温酶的,如果你是重组表达,那么水浴时间对酶的影响好象不是很大 30min足够,温度70C就够了。透析一般冰上做,换2小时一次 做两次就好了。高温酶在常温下都是很稳定的,在室温下放24h,酶活都不会变化的。你那么不稳定,应该是保存条件不太对。
2楼2009-05-03 15:16:14
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)


楼上的 告诫 很中肯。
3楼2009-05-03 19:06:45
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)


xiaoxueliu(金币+1,VIP+0):谢谢 5-6 16:29
酶的表达和提取要注意的地方很多,比如你的菌液培养时间和诱导表达的温度,你需要去摸索一条最适合的途径,才能得到高表达量和比活,如果是诱导表达还要注意诱导od值。酶的保存,如果是-20度的话可以加10-50%的甘油和dtt,如果-70的话可以液氮速冻再保存,也可叫甘油后保存。但是无论那种方法,酶蛋白要避免反复冻融,反复冻融最影响酶的活性,不知道你是不是反复冻融你的Taq了
4楼2009-05-03 22:18:37
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

还有透析一般要保持低温,你可以在4度冰箱里透析,其间多换几次液可以减少透析时间
5楼2009-05-03 22:19:50
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lsbrc

银虫 (小有名气)


xiaoxueliu(金币+1,VIP+0):谢谢 5-6 16:29
提得Taq酶活性不高,还有一个特点就是刚开始用还可以,用过2,3次酶的活性越来越低。说明酶的纯度不够,很可能含有蛋白酶污染,建议跑SDS-PAGE检测一下。Taq本身非常稳定,但在储存过程中,需要加些如Triton、NP40或Geltin等作为Stablizer。
6楼2009-05-04 08:49:55
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