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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Taq酶提取问题，急切希望得到指点
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xiaoxueliu

木虫 (著名写手)

[交流] Taq酶提取问题，急切希望得到指点

那位提取过Taq酶的高手给指点一下：我提得Taq酶活性不高，还有一个特点就是刚开始用还可以，用过2，3次酶的活性越来越低，请问在酶的提取过程中有哪些细节需要注意，还有几个问题：
1，菌液培养的时间和量度？
2，提取过程中离心，水浴的注意事项
3，透析的时间和注意事项，如果透析时间过长，或中间透析时间过长才换新的透析液对美的质量会有什么影响？
急切想得到高手指点，谢谢，谢谢！！！
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1楼 2009-05-03 13:34:28
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lsbrc

银虫 (小有名气)
★
xiaoxueliu(金币+1,VIP+0):谢谢 5-6 16:29
提得Taq酶活性不高，还有一个特点就是刚开始用还可以，用过2，3次酶的活性越来越低。说明酶的纯度不够，很可能含有蛋白酶污染，建议跑SDS-PAGE检测一下。Taq本身非常稳定，但在储存过程中，需要加些如Triton、NP40或Geltin等作为Stablizer。
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6楼2009-05-04 08:49:55
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jqq1985

银虫 (正式写手)
★ ★
xiaoxueliu(金币+2,VIP+0):谢谢，不过保存液中有50%的甘油啊 5-6 16:27
你说开始还行，后面不行了，应该是保存的问题把。往保存液中加到10%甘油和1mM DTT吧，那样保存效果好些。还有分管保藏，不要每次都从一个管子里面取。我原来也是做高温酶的，如果你是重组表达，那么水浴时间对酶的影响好象不是很大 30min足够，温度70C就够了。透析一般冰上做，换2小时一次 做两次就好了。高温酶在常温下都是很稳定的，在室温下放24h，酶活都不会变化的。你那么不稳定，应该是保存条件不太对。
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2楼2009-05-03 15:16:14
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
楼上的 告诫 很中肯。
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3楼2009-05-03 19:06:45
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★
xiaoxueliu(金币+1,VIP+0):谢谢 5-6 16:29
酶的表达和提取要注意的地方很多，比如你的菌液培养时间和诱导表达的温度，你需要去摸索一条最适合的途径，才能得到高表达量和比活，如果是诱导表达还要注意诱导od值。酶的保存，如果是-20度的话可以加10-50%的甘油和dtt，如果-70的话可以液氮速冻再保存，也可叫甘油后保存。但是无论那种方法，酶蛋白要避免反复冻融，反复冻融最影响酶的活性，不知道你是不是反复冻融你的Taq了
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4楼2009-05-03 22:18:37
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