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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » SmaI和xbaI双酶切
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sdauxxx

新虫 (小有名气)

[交流] SmaI和xbaI双酶切

用PBI2301构建植物表达载体时，用smaI和xbaI双酶切，连接后一直筛不出阳性克隆；后来换用XmaI酶切，回收后再用XbaI酶切，连接后依然没有筛出阳性克隆。（XmaI酶是smaI的同裂酶），xmaI和xbaI不是一个公司的，所以分步酶切。

一直没有筛选出，请问有人能做过这方面吗？我该怎么改进，说具体点，万分感谢！
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1楼 2009-04-28 22:15:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
听起来是连接出了问题更多一些……
什么公司的内切酶和连接酶呢？片段多大？
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2楼2009-04-28 22:29:19
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anik

银虫 (正式写手)
我们这边也在做类似的实验，我们用的是PBI121 ，酶切也遇到点问题。。。

酶切后质粒的量很多，但目的片断很少，几乎看不到。也在找原因。。。。
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3楼2009-04-28 23:27:09
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anik

银虫 (正式写手)
楼主在南京哪所学校？
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4楼2009-04-28 23:28:19
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sdauxxx

新虫 (小有名气)

SmaI和xbaI双酶切

在南京农大 XmaI是NEB公司的 XbaI是宝生物公司的 请大家多指教
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5楼2009-04-28 23:31:26
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sdauxxx

新虫 (小有名气)

SmaI和xbaI双酶切

载体是1.6K   片段是1.1K
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6楼2009-04-28 23:33:33
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
不同公司的酶，不能同时双酶切
要分步
takara的东西……呃……要不你试试先用Xba I单切质粒，看看有没有切干净吧
没切干净是一个原因
还有就是连接不好~~
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7楼2009-04-28 23:37:25
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stfo

铜虫 (小有名气)
用过这两个酶
我当初是分步酶切后连接的

建议换个连接酶吧

SmaI是平末端吧

我用的是
Fermentas快速连接试剂盒
你可以试试
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8楼2009-04-29 14:03:02
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
也遇到过相同的问题，我当时先是单酶切回收后再酶切回收，连接也出了问题。后来还是两种酶同时切但是把酶切体系放大几倍（质粒量，酶量不变，buffer量相应扩大倍数，其余空白用水补齐）酶切时间过夜。回收后连接成功了。不妨试试。
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Thank-you，so-blue.
9楼2009-04-29 15:35:04
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