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sdauxxx

新虫 (小有名气)

[交流] SmaI和xbaI双酶切

用PBI2301构建植物表达载体时,用smaI和xbaI双酶切,连接后一直筛不出阳性克隆;后来换用XmaI酶切,回收后再用XbaI酶切,连接后依然没有筛出阳性克隆。(XmaI酶是smaI的同裂酶),xmaI和xbaI不是一个公司的,所以分步酶切。

一直没有筛选出,请问有人能做过这方面吗?我该怎么改进,说具体点,万分感谢!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

听起来是连接出了问题更多一些……
什么公司的内切酶和连接酶呢?片段多大?
2楼2009-04-28 22:29:19
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anik

银虫 (正式写手)

我们这边也在做类似的实验,我们用的是PBI121 ,酶切也遇到点问题。。。

酶切后质粒的量很多,但目的片断很少,几乎看不到。也在找原因。。。。
3楼2009-04-28 23:27:09
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anik

银虫 (正式写手)

楼主在南京哪所学校?
4楼2009-04-28 23:28:19
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sdauxxx

新虫 (小有名气)

SmaI和xbaI双酶切

在南京农大 XmaI是NEB公司的 XbaI是宝生物公司的 请大家多指教
5楼2009-04-28 23:31:26
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sdauxxx

新虫 (小有名气)

SmaI和xbaI双酶切

载体是1.6K   片段是1.1K
6楼2009-04-28 23:33:33
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

不同公司的酶,不能同时双酶切
要分步
takara的东西……呃……要不你试试先用Xba I单切质粒,看看有没有切干净吧
没切干净是一个原因
还有就是连接不好~~
7楼2009-04-28 23:37:25
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stfo

铜虫 (小有名气)

用过这两个酶
我当初是分步酶切后连接的

建议换个连接酶吧

SmaI是平末端吧

我用的是
Fermentas快速连接试剂盒
你可以试试
8楼2009-04-29 14:03:02
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

也遇到过相同的问题,我当时先是单酶切回收后再酶切回收,连接也出了问题。后来还是两种酶同时切但是把酶切体系放大几倍(质粒量,酶量不变,buffer量相应扩大倍数,其余空白用水补齐)酶切时间过夜。回收后连接成功了。不妨试试。
Thank-you,so-blue.
9楼2009-04-29 15:35:04
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