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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大片段 重叠PCR
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jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] 大片段 重叠PCR

片段A 2.4K
片段B 3K
A和B进行重叠PCR
首先进行了梯度PCR（体系20μl），发现退火温度68-72之间都可以看到目的条带  只是不是特别亮的条带

之后用71℃的退火温度进行重叠PCR，100μl体系，结果并没有看到目的条带！

怀疑100μl体系配置的时候可能是人为原因出现问题，又重新进行了一次梯度PCR，结果与第一次一样，68-72℃能出现条带。  后又重新大体系进行了一次  但是仍然没有条带

之后怀疑大体系不能成功就配了500μl的体系每20μl分装到小PCR管里  但是仍未成功

不知道什么原因  请做重叠PCR的大神赐教  感激涕零！
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初来乍到··
1楼 2018-11-19 15:32:49
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
模板可以增加一些试试

发自小木虫Android客户端
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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
2楼2018-11-19 16:00:21
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cccyb123

铜虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-11-20 10:14:17
用的引物退火温度多少？PFU的延伸温度？
你可以尝试把之前P出来的加点进去做模板
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3楼2018-11-19 16:33:07
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cccyb123 at 2018-11-19 16:33:07
用的引物退火温度多少？PFU的延伸温度？
你可以尝试把之前P出来的加点进去做模板

两端引物退火温度60℃左右    但是两个片段的重叠区退火温度大概69℃   PFU的延伸温度72℃    我尝试着加2μl到20μl体系里当模板   但是什么都没有  也可能我加的太多了？
20μl体系加的模板（两个片段）接近200ng了   我试着做过不同浓度模板的比较  结果产物亮度差不多  中间的最亮最后就确定的这个浓度
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初来乍到··
4楼2018-11-20 13:56:10
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2018-11-19 16:00:21
模板可以增加一些试试

20μl体系加的模板（两个片段）接近200ng了  这还不多？     我试着做过不同浓度模板的比较  结果产物亮度差不多  中间的最亮最后就确定的这个浓度
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初来乍到··
5楼2018-11-20 13:57:02
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cccyb123

铜虫 (小有名气)
内容已删除
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6楼2018-11-20 14:55:35
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1034714749

铜虫 (小有名气)
感觉上退火温度应该是略高了，之前做重叠pcr的重叠去退火温度都在75℃作用，但需要设置在68左右才有结果。模板浓度也高，多试几下就OK了
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7楼2018-11-20 17:13:14
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 1034714749 at 2018-11-20 17:13:14
感觉上退火温度应该是略高了，之前做重叠pcr的重叠去退火温度都在75℃作用，但需要设置在68左右才有结果。模板浓度也高，多试几下就OK了

退火温度是梯度PCR摸索的  68-72之间才能P出条带  模板浓度我再试着调整一下吧  谢谢！
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初来乍到··
8楼2018-11-21 08:11:18
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jjsh310

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cccyb123 at 2018-11-20 14:55:35
个人感觉 模板太多了吧
也可以加1ul DMSO 降低退火温度
95-68-72 10 runs， then 95-71-72 20 runs...

DMSO不是用于难P的模板吗？因为我的第一轮PCR得到的产物都特别多 所以就没考虑DMSO   我尝试着降低模板量试一下您推荐的循环程序
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初来乍到··
9楼2018-11-21 08:12:52
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cccyb123

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jjsh310 at 2018-11-21 08:12:52
DMSO不是用于难P的模板吗？因为我的第一轮PCR得到的产物都特别多 所以就没考虑DMSO   我尝试着降低模板量试一下您推荐的循环程序...

DMSO可以降低富含GC模板的退火温度
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10楼2018-11-21 08:32:34
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