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jjsh310

金虫 (小有名气)

[求助] 大片段 重叠PCR

片段A 2.4K
片段B 3K
A和B进行重叠PCR
首先进行了梯度PCR(体系20μl),发现退火温度68-72之间都可以看到目的条带  只是不是特别亮的条带

之后用71℃的退火温度进行重叠PCR,100μl体系,结果并没有看到目的条带!

怀疑100μl体系配置的时候可能是人为原因出现问题,又重新进行了一次梯度PCR,结果与第一次一样,68-72℃能出现条带。  后又重新大体系进行了一次  但是仍然没有条带

之后怀疑大体系不能成功就配了500μl的体系每20μl分装到小PCR管里  但是仍未成功

不知道什么原因  请做重叠PCR的大神赐教  感激涕零!
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初来乍到··
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jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2018-11-19 16:00:21
模板可以增加一些试试

20μl体系加的模板(两个片段)接近200ng了  这还不多?     我试着做过不同浓度模板的比较  结果产物亮度差不多  中间的最亮最后就确定的这个浓度
初来乍到··
5楼2018-11-20 13:57:02
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

知识就像蒲公英的花儿一样,播种在世界的每一个角落。
2楼2018-11-19 16:00:21
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cccyb123

铜虫 (小有名气)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-11-20 10:14:17
用的引物退火温度多少?PFU的延伸温度?
你可以尝试把之前P出来的加点进去做模板
3楼2018-11-19 16:33:07
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jjsh310

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cccyb123 at 2018-11-19 16:33:07
用的引物退火温度多少?PFU的延伸温度?
你可以尝试把之前P出来的加点进去做模板

两端引物退火温度60℃左右    但是两个片段的重叠区退火温度大概69℃   PFU的延伸温度72℃    我尝试着加2μl到20μl体系里当模板   但是什么都没有  也可能我加的太多了?
20μl体系加的模板(两个片段)接近200ng了   我试着做过不同浓度模板的比较  结果产物亮度差不多  中间的最亮最后就确定的这个浓度
初来乍到··
4楼2018-11-20 13:56:10
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