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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切问题
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04swlcm

金虫 (小有名气)

[交流] 酶切问题

大家好，我想问一下，PCR产物可以直接酶切吗？（设计引物时已加酶切位点和保护碱基）还是需要与T载体连接后在酶切呢？非常感谢！
另外，我想知道芽孢杆菌感受态细胞的制备与大肠杆菌感受态制备有区别吗？制备时有没有特别需要注意的？Thank  you！
请大家不吝赐教，小女子先谢了哈！哈哈
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1楼 2009-04-22 21:44:49
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bbyu007

木虫 (正式写手)
可以直接酶切，第二个问题不知道
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我是笨笨鱼~~~
2楼2009-04-22 22:01:37
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04swlcm

金虫 (小有名气)
还是很感谢啦……
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3楼2009-04-22 22:15:06
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wuer413023

至尊木虫 (文坛精英)

没事领金币
我有一个师兄做芽孢杆菌感受态的，明天我帮你问问
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上邪!我欲与君相知，长命无绝衰。山无陵，江水为竭，冬雷震震，夏雨雪，天地合，乃敢与君绝！
4楼2009-04-22 22:58:50
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anik

银虫 (正式写手)
酶切后出现粘性末端。。。。PCR 产物不是粘性末端。不过，酶切前最好跑胶回收，PCR产物混合物会影响酶的功能。
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5楼2009-04-22 23:26:01
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wuer413023 at 2009-4-22 22:58:
我有一个师兄做芽孢杆菌感受态的，明天我帮你问问

先谢谢了哈，(*^__^*)
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6楼2009-04-23 00:01:43
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cascc

铜虫 (小有名气)
即使加了保护碱基切得效率也比较低，我建议你不必省这点事情，到后来有问题更麻烦，况且连接到T载体上测序和克隆都方便些。你觉得呢？也就是多花一天时间。
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7楼2009-04-24 21:56:18
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04swlcm

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by cascc at 2009-4-24 21:56:
即使加了保护碱基切得效率也比较低，我建议你不必省这点事情，到后来有问题更麻烦，况且连接到T载体上测序和克隆都方便些。你觉得呢？也就是多花一天时间。

是吗？我才接触分子，我是做定向进化（易错PCR），我需要在巨大芽孢杆菌里表达，再筛选有益突变子。
你说的就相当于把易错PCR产物连在T载体上，再酶切出目的基因，在与表达载体连接…………？？？这一步就相当于增加酶切效率？？我看有些文献是直接切的，
我才接触分子实验，很多地方不太懂，希望大家多提意见，多交流！谢谢
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8楼2009-04-24 23:41:04
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cascc

铜虫 (小有名气)
如果你要做表达，建议还是先将片段连接到T载体后测序，正确后再从T载体切下连接到表达载体，建议使用保真性好的酶，防止点突变。但是记得如果用高保真酶，PCR反应结束后加上A，这样才能连接到T载体。如果你直接PCR产物测序，是测不到点突变的，不能反映真实情况。
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9楼2009-04-25 11:52:41
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