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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：大肠ET12567的转化问题
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

[交流] 求助：大肠ET12567的转化问题

我将构建好的一个质粒（大约8500bp)转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态，菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确，将验证正确的菌用20％甘油保存在－20度；
      此时问题出现了：将甘油保藏管菌液重新接LB小试管（含抗性），提质粒，但是此时却见不到质粒的条带了，Why？（ps:提质粒用的试剂是别人刚刚提过质粒的，应该没问题；LB小试管菌长得很好很正常）。我也试过将甘油保藏管菌液先在LB（含同样抗生素）平板活化，然后再接小试管提质粒，结果电泳也没见到我所要的质粒条带（PS：电泳和别人一起跑的，别人的有条带，电泳应该是没问题的）
      很急，请各位大牛帮忙分析分析，这到底是怎么回事？难道我的质粒保藏过程中丢失了？苦想了好久，也试验过好几次都是如此，也找不出原因，特此求教！拜谢！

[ Last edited by zhaoxiag on 2009-4-22 at 12:15 ]
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1楼 2009-04-21 17:19:48
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
说明一下：ET12567含卡那和氯霉素抗性；我的质粒带安普抗性的；LB抗性平板和小试管是三种抗性都加的
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2楼2009-04-21 17:22:48
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zhyzx

金虫 (小有名气)
★
zhaoxiag(金币+1,VIP+0):谢谢 4-21 19:40
个人觉得问题应该出在保菌之前。
学习中。。。
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3楼2009-04-21 19:13:44
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhyzx at 2009-4-21 19:13:
个人觉得问题应该出在保菌之前。
学习中。。。

菌的保藏应该没什么问题的，之前都是这样保的大肠没什么问题，非常重要的一点是，甘油保藏管菌液接在抗性培养基上长得很正常的
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4楼2009-04-21 19:43:58
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
大家帮忙看看啊，谢了哈
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5楼2009-04-22 12:22:34
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gandalf886

银虫 (小有名气)
★
zhaoxiag(金币+1):谢谢参与
我也遇到过同样的问题
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6楼2009-04-22 22:45:29
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songfenzz

银虫 (小有名气)
★
zhaoxiag(金币+1):谢谢参与
期待各位高手的答复。。。。。谢谢！
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多谢交流~~共同进步！
7楼2009-04-22 23:44:28
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
期待高手的回答，感激不尽！

[ Last edited by zhaoxiag on 2009-4-23 at 08:25 ]
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8楼2009-04-23 08:23:59
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gandalf886 at 2009-4-22 22:45:
我也遇到过同样的问题

那你最后是如何解决的呢？
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9楼2009-04-23 08:25:56
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
zhaoxiag(金币+1):谢谢参与
zhaoxiag(金币+3,VIP+0):非常感谢！ 4-23 10:24
引用回帖:
Originally posted by zhaoxiag at 2009-4-21 17:22:
说明一下：ET12567含卡那和氯霉素抗性；我的质粒带安普抗性的；LB抗性平板和小试管是三种抗性都加的

ET12567有大量的核酸酶,易降解质粒DNA。是不是质粒被降解了？看ET12567是不是RecA缺陷型，如果不是，可能质粒被降解，之所以抗安普，估计质粒上的抗性基因被整合到菌的基因组上。
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Thank-you，so-blue.
10楼2009-04-23 08:45:58
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