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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于载体与基因连接的问题
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 求助关于载体与基因连接的问题

上次P了一个基因，连进pET28a，用的是BamHI和HindIII的酶切位点。当时连接效率就很低，好几次都没有长出克隆，最后一次长出了一个克隆，送测序结果基因发生了单碱基突变。为了纠正这个突变，做了overlapPCR，结果显示分别P出了突变为点上游和下游的片段，大小无误。再分别以这两个PCR产物为模板，又成功P出了目的基因大小的片段，酶切并胶回收后再检验条带大小也正常，可是这次不管怎样连接产物转化B21感受态后都没有克隆长起。
我用的是Fermentas的内切酶和Takara的连接酶，胶回收试剂盒是Omega的。感受态经检验是没有问题的。
各位大侠能帮着分析分析么？

[ Last edited by xuehu2008 on 2009-4-20 at 12:12 ]
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1楼 2009-04-20 08:56:48
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 4-20 12:14
从你的叙述来看，能够回收到电泳正常的片断，在pcr上应该是正确的，问题可能处在连接上。你可以增大目的基因与载体的比例，换一下Fermentas的内切酶，毕竟一个公司的酶体系上的冲突要小一些。实在不行，你试一下用Dpn1单点突变你的突变的错误载体吧。
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2楼2009-04-20 09:10:01
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 4-20 12:14
Fermentas的内切酶是蛮好的
就是takara的连接酶非常烂
同时omega的回收试剂盒，回收率非常低
这里出错在回收率低下和连接效率低下
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3楼2009-04-20 09:36:33
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 4-20 12:14
纠正点突变还是用定点突变试剂盒比较方便
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4楼2009-04-20 10:01:32
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)
谢谢大家！想问 三磷酸腺苷：能否推荐一下连接酶和胶回收试剂盒？
请教 elvias  ，Dpn1是怎样一种方法？
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5楼2009-04-20 12:14:22
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by xuehu2008 at 2009/4/20, 12:14:
谢谢大家！想问 三磷酸腺苷：能否推荐一下连接酶和胶回收试剂盒？
请教 elvias  ，Dpn1是怎样一种方法？

NEB和Fermentas的T4连接酶都不错
我也用了TOYOBO的ligation high Ver.2，一直很稳定
胶回收试剂盒，全世界最好的当然是QIAGEN的
国产的天根其实也是ok的，不贵，但比omega好几百倍吧……
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6楼2009-04-20 12:33:21
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)
лл
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7楼2009-04-20 13:02:15
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
其实回收，标准是能收回来就行，一般回收效率都能在50%以上，我用过好多家国产的，也有用进口的，其实对后续反应影响不大，现在国内的厂家试剂盒的柱子都是进口的，所以也不用迷恋外国货。连接酶可以选择好一些的，NEB，Fermentas和Promega可以说是国际上最好的三个酶公司，产品有保证。国产的连接酶我也用过，最快的连接10min，效率也不错。
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8楼2009-04-20 16:50:06
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
xuehu2008(金币+2,VIP+0):受益匪浅，多谢啦！ 4-22 00:45
Dpn1就是通过对你从大肠杆菌中提取的质粒进行全长pcr，你的引物可以设计为定点突变。然后用Dpn1这个酶消化，其只能消化大肠杆菌甲基化的质粒。
Dpn1你可以问下NEB，好像还送你长片断高保真PCR酶。
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9楼2009-04-20 16:53:46
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