应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于载体与基因连接的问题
51/1返回列表
查看: 853  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 求助关于载体与基因连接的问题

上次P了一个基因，连进pET28a，用的是BamHI和HindIII的酶切位点。当时连接效率就很低，好几次都没有长出克隆，最后一次长出了一个克隆，送测序结果基因发生了单碱基突变。为了纠正这个突变，做了overlapPCR，结果显示分别P出了突变为点上游和下游的片段，大小无误。再分别以这两个PCR产物为模板，又成功P出了目的基因大小的片段，酶切并胶回收后再检验条带大小也正常，可是这次不管怎样连接产物转化B21感受态后都没有克隆长起。
我用的是Fermentas的内切酶和Takara的连接酶，胶回收试剂盒是Omega的。感受态经检验是没有问题的。
各位大侠能帮着分析分析么？

[ Last edited by xuehu2008 on 2009-4-20 at 12:12 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2009-04-20 08:56:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

elvias

铁杆木虫 (正式写手)
其实回收，标准是能收回来就行，一般回收效率都能在50%以上，我用过好多家国产的，也有用进口的，其实对后续反应影响不大，现在国内的厂家试剂盒的柱子都是进口的，所以也不用迷恋外国货。连接酶可以选择好一些的，NEB，Fermentas和Promega可以说是国际上最好的三个酶公司，产品有保证。国产的连接酶我也用过，最快的连接10min，效率也不错。
赞一下 回复此楼
8楼2009-04-20 16:50:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 4-20 12:14
从你的叙述来看，能够回收到电泳正常的片断，在pcr上应该是正确的，问题可能处在连接上。你可以增大目的基因与载体的比例，换一下Fermentas的内切酶，毕竟一个公司的酶体系上的冲突要小一些。实在不行，你试一下用Dpn1单点突变你的突变的错误载体吧。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2009-04-20 09:10:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 4-20 12:14
Fermentas的内切酶是蛮好的
就是takara的连接酶非常烂
同时omega的回收试剂盒，回收率非常低
这里出错在回收率低下和连接效率低下
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2009-04-20 09:36:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
xuehu2008(金币+1,VIP+0):谢谢 4-20 12:14
纠正点突变还是用定点突变试剂盒比较方便
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2009-04-20 10:01:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 4/200 2026-11-07 16:28 by Xc2FxHsHkBNc
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 5/250 2026-11-07 16:06 by Xc2FxHsHkBNc
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 23/1150 2026-11-07 06:49 by Equinoxhua
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:23 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 18/900 2026-11-06 13:36 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 10/500 2026-11-06 12:32 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:15 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-06 01:51 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:42 by qL1cU46YIdK0
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-05 11:10 by PYZmcHr5kSaq
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭