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rainontime

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌转化线性DNA已有2人参与

一般我们都会用热击的方法转质粒进感受态细胞。如果要转化的对象是线性DNA,请问要怎么操作呢?谢谢!
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宁心king

新虫 (正式写手)

★ ★ ★
snoopytbw: 金币+3, 专业 2018-11-29 14:25:12
高温才会造成蛋白不可逆变性  电转时电击时间很短,其实电击是会造成部分菌死亡的 所以合适的电压很重要  你该了解下蛋白变性相关知识

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

9楼2018-11-28 14:43:41
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宁心king

新虫 (正式写手)

那你应该看一下终止子位置  起始密码子和终止密码子是调控翻译的

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12楼2018-11-28 16:53:20
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宁心king

新虫 (正式写手)

2楼2018-11-05 13:29:39
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rainontime

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 宁心king at 2018-11-05 13:29:39
电转化

实验室没有电转仪。。。请问需要什么耗材吗?
3楼2018-11-05 13:52:16
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宁心king

新虫 (正式写手)

电转仪,,,电击杯

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4楼2018-11-05 14:34:09
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zhz0809

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1。首先线性化的DNA是不能直接转化感受态细胞的
2。线性化的DNA(一般指载体)需要通过连接酶(T4,TOPO酶,无缝克隆)等连接成闭合的环状才能转化感受态细胞
3。你指的是感受态细胞效率低?如果是感受态细胞效率低,可以选用商业化的感受态;或者采用电转的方式转化
5楼2018-11-15 11:22:17
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rainontime

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 宁心king at 2018-11-05 14:34:09
电转仪,,,电击杯

请问电转进去的线性DNA会自我降解吗?还是一直留在菌体中呢?谢谢!
6楼2018-11-27 11:03:31
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宁心king

新虫 (正式写手)


小冀-: 金币+1, 鼓励回帖,有帮助 2018-11-28 14:45:20
引用回帖:
6楼: Originally posted by rainontime at 2018-11-27 11:03:31
请问电转进去的线性DNA会自我降解吗?还是一直留在菌体中呢?谢谢!...

会降解  需要一种蛋白保护片段不被降解  如pkd46便可产生

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7楼2018-11-27 23:30:53
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rainontime

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 宁心king at 2018-11-27 23:30:53
会降解  需要一种蛋白保护片段不被降解  如pkd46便可产生
...

谢谢!我最近已经开始做电转了,在制作感受态这一步时有一个困惑。第二天在转接菌之后,加入阿拉伯糖诱导剂,使gam、beta和exo三个蛋白表达,然后再收菌制备感受态细胞。这些蛋白不会因为放入-80℃冰箱再拿出来而失活吗?电转的时候那么大电压也对蛋白活性没有影响吗?想不太明白,还请前辈指教一二,谢谢~~~
8楼2018-11-28 14:22:26
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by rainontime at 2018-11-28 14:22:26
谢谢!我最近已经开始做电转了,在制作感受态这一步时有一个困惑。第二天在转接菌之后,加入阿拉伯糖诱导剂,使gam、beta和exo三个蛋白表达,然后再收菌制备感受态细胞。这些蛋白不会因为放入-80℃冰箱再拿出来而失 ...

首先呢,表达的蛋白在胞内,未分泌到胞外,只要菌体活着,应该会有活性;但是时间长的话会降解、失活,而且低温保存时间长,感受态转化效率也会降低,所以我们敲除的感受态是现做现用,效率比较高;第二点,电转的时候,绝大多数的细胞应该都被电死了,所以电转的感受态一般浓度比氯化钙感受态要大得多
···
10楼2018-11-28 14:44:58
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