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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 大肠杆菌转化线性DNA
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rainontime

新虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌转化线性DNA 已有2人参与

一般我们都会用热击的方法转质粒进感受态细胞。如果要转化的对象是线性DNA，请问要怎么操作呢？谢谢！
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1楼 2018-11-05 13:09:42
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宁心king

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
snoopytbw: 金币+3, 专业 2018-11-29 14:25:12
高温才会造成蛋白不可逆变性  电转时电击时间很短，其实电击是会造成部分菌死亡的 所以合适的电压很重要  你该了解下蛋白变性相关知识

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rainontime
9楼2018-11-28 14:43:41
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宁心king

新虫 (正式写手)
那你应该看一下终止子位置  起始密码子和终止密码子是调控翻译的

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12楼2018-11-28 16:53:20
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宁心king

新虫 (正式写手)
电转化

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2楼2018-11-05 13:29:39
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rainontime

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 宁心king at 2018-11-05 13:29:39
电转化

实验室没有电转仪。。。请问需要什么耗材吗？
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3楼2018-11-05 13:52:16
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宁心king

新虫 (正式写手)
电转仪，，，电击杯

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4楼2018-11-05 14:34:09
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zhz0809

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1。首先线性化的DNA是不能直接转化感受态细胞的
2。线性化的DNA（一般指载体）需要通过连接酶（T4，TOPO酶，无缝克隆）等连接成闭合的环状才能转化感受态细胞
3。你指的是感受态细胞效率低？如果是感受态细胞效率低，可以选用商业化的感受态；或者采用电转的方式转化
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5楼2018-11-15 11:22:17
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rainontime

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 宁心king at 2018-11-05 14:34:09
电转仪，，，电击杯

请问电转进去的线性DNA会自我降解吗？还是一直留在菌体中呢？谢谢！
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6楼2018-11-27 11:03:31
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宁心king

新虫 (正式写手)
★
小冀-: 金币+1, 鼓励回帖，有帮助 2018-11-28 14:45:20
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6楼: Originally posted by rainontime at 2018-11-27 11:03:31
请问电转进去的线性DNA会自我降解吗？还是一直留在菌体中呢？谢谢！...

会降解  需要一种蛋白保护片段不被降解  如pkd46便可产生

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7楼2018-11-27 23:30:53
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rainontime

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 宁心king at 2018-11-27 23:30:53
会降解  需要一种蛋白保护片段不被降解  如pkd46便可产生
...

谢谢！我最近已经开始做电转了，在制作感受态这一步时有一个困惑。第二天在转接菌之后，加入阿拉伯糖诱导剂，使gam、beta和exo三个蛋白表达，然后再收菌制备感受态细胞。这些蛋白不会因为放入-80℃冰箱再拿出来而失活吗？电转的时候那么大电压也对蛋白活性没有影响吗？想不太明白，还请前辈指教一二，谢谢~~~
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8楼2018-11-28 14:22:26
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by rainontime at 2018-11-28 14:22:26
谢谢！我最近已经开始做电转了，在制作感受态这一步时有一个困惑。第二天在转接菌之后，加入阿拉伯糖诱导剂，使gam、beta和exo三个蛋白表达，然后再收菌制备感受态细胞。这些蛋白不会因为放入-80℃冰箱再拿出来而失 ...

首先呢，表达的蛋白在胞内，未分泌到胞外，只要菌体活着，应该会有活性；但是时间长的话会降解、失活，而且低温保存时间长，感受态转化效率也会降低，所以我们敲除的感受态是现做现用，效率比较高；第二点，电转的时候，绝大多数的细胞应该都被电死了，所以电转的感受态一般浓度比氯化钙感受态要大得多
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···
10楼2018-11-28 14:44:58
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