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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » DNA与t载体连接后的测序
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米饭陈

新虫 (小有名气)

[求助] DNA与t载体连接后的测序 已有1人参与

DNA与T载体连接转化后测序，得到的结果，碱基总数竟然比T载体自身的还要少。请问这是什么原因啊？

@biostar2009 @youlinglyw @wizardfan 发自小木虫Android客户端
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1楼 2018-10-27 19:13:47
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棍子168

至尊木虫 (著名写手)
你是测通还是一个反应

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天道酬勤
2楼2018-10-27 22:33:51
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-10-28 09:52:16
首先，你测序用的是T载体通用引物还是自己DNA的特异性引物?
第二，测序了多少个反应，有没测通？
第三，各个厂商的T载体大小不一，你说的T载体碱基数是个什么概念？
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*才随遇长，识以穷精*
3楼2018-10-27 23:03:57
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米饭陈

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 棍子168 at 2018-10-27 22:33:51
你是测通还是一个反应

我是测通

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4楼2018-10-28 13:25:41
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米饭陈

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ghst110 at 2018-10-27 23:03:57
首先，你测序用的是T载体通用引物还是自己DNA的特异性引物?
第二，测序了多少个反应，有没测通？
第三，各个厂商的T载体大小不一，你说的T载体碱基数是个什么概念？

我用的T载体是通用引物，测通了，用的PMD18T载体，我看的厂家的说明书，序列有2000多碱基。

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5楼2018-10-28 13:27:49
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米饭陈

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ghst110 at 2018-10-27 23:03:57
首先，你测序用的是T载体通用引物还是自己DNA的特异性引物?
第二，测序了多少个反应，有没测通？
第三，各个厂商的T载体大小不一，你说的T载体碱基数是个什么概念？

就是t载体与我的目的DNA片段连接后测通，序列只有1000多，比PMD18自身的还短。请问您知道这是什么原因吗

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6楼2018-10-28 13:29:41
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ghst110

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 米饭陈 at 2018-10-28 13:29:41
就是t载体与我的目的DNA片段连接后测通，序列只有1000多，比PMD18自身的还短。请问您知道这是什么原因吗
...

测通是指测出你插入的DNA全部序列。T载体本身的序列部分，测序公司是不会测的吧，测这部分第一已知的载体序列是已知的，没必要，二是多测了，费用谁出？
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*才随遇长，识以穷精*
7楼2018-10-28 18:47:11
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我来简单说一下测序几个常用的概念吧1.正向测序，基本是安排T载体的F向测序引物，一个反应。
2.反向测序，R向一个反应。
3.正向测通，使用F引物，测一个，然后继续结果继续设计测序引物加测，直到测通（测到下游载体序列为止）。例如，插入400-500bp，那么1和3是一样的，一个测序反应就ok.如果插入1200bp，那就要使用两个引物测序。
4.反向测通，和3相似，反向来，直到得到全部目的序列。
5.双向测通，3,4正反向测序同时进行，双向都测，相当于测了两遍，双重验证，结果也更确切。

具体采用哪种测序，需要根据片段长度，实验目的，和花费费用等等来决定。
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*才随遇长，识以穷精*
8楼2018-10-28 18:55:53
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米饭陈

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ghst110 at 2018-10-28 18:55:53
我来简单说一下测序几个常用的概念吧1.正向测序，基本是安排T载体的F向测序引物，一个反应。
2.反向测序，R向一个反应。
3.正向测通，使用F引物，测一个，然后继续结果继续设计测序引物加测，直到测通（测到下游载 ...

谢谢您，这个序列长短问题我懂啦。还想向您请教一个问题，就是我用DNAman进行多序列同源性比对时，首先选择sequence-Alignment-Multiple Sequence Alignment。然后将我的序列用文档形式导入，再设置其他参数，以及选择DNA确定后，出现了……does not appear to be DNA。请问您知道我是哪里设置错了吗？

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9楼2018-10-29 21:09:43
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ghst110

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 米饭陈 at 2018-10-29 21:09:43
谢谢您，这个序列长短问题我懂啦。还想向您请教一个问题，就是我用DNAman进行多序列同源性比对时，首先选择sequence-Alignment-Multiple Sequence Alignment。然后将我的序列用文档形式导入，再设置其他参数，以及 ...

我DNAman用的比较少，不太能直接回答你的设置问题，我猜可能你的文档里有非代表DNA序列的字母或者符号吧。多序列比对（包括氨基酸序列）我常用的是MEGA 7与 ClastalX
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*才随遇长，识以穷精*
10楼2018-10-29 23:16:30
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